Unité: Immunologie Moléculaire des Parasites - CNRS URA 2581

Responsable: PUIJALON Odile

La thématique centrale de l'Unité est l'analyse des facteurs qui déterminent l'issue d'une infection palustre, avec comme but de mettre au point un vaccin prévenant la pathologie palustre. Nous développons un programme intégré de recherche fondamentale sur la pathologie due à Plasmodium falciparum chez l'homme et dans le modèle de l'infection expérimentale du singe Saimiri sciureus , et des programmes sur le développement de vaccins ciblant des molécules de surface conservées des stades sanguins asexués. L'analyse intégrée de pathologie palustre comprend : l'exploration de l'activation des cellules immunocompétentes dans l'accès palustre, l'identification de nouveaux facteurs parasitaires de pathogénicité par une approche de génétique réverse et par exploration du transcriptome parasitaire à l'aide de puces à ADN, l'analyse du rôle de la rate dans un modèle expérimental d'organe perfusé et une étude multicentrique du polymorphisme parasitaire et de ses conséquences sur les réponses immunes. Le programme de développement vaccinal cible des molécules conservées de la surface du mérozoïte ou du globule rouge infecté.RésuméRésumé :

La thématique centrale de l'Unité est l'analyse intégrée des éléments qui déterminent l'issue de l'infection par P.falciparum. Quatre axes de recherche sont poursuivis : analyse de l'activation des cellules immunocompétentes au cours de l'accès palustre, recherche de facteurs parasitaires de virulence, exploration du rôle de la rate dans un modèle d'organe humain perfusé, et étude de la diversité parasitaire en zone d'endémie.

Notre objectif à long terme est le développement de vaccins prévenant la mortalité et la morbidité palustre. Pour ce faire, nous cherchons à mieux cerner le rôle respectif des facteurs de l'hôte et du parasites sur l'issue de l'infection et sa présentation clinique.

1. Rôle de l'activation immune dans la physiopathologie du paludisme (C.Behr, S.Loizon, P.Boeuf, F. Remerand, J.C.Michel).

Nous étudions l'activation du système immunitaire dans différentes formes cliniques de paludisme à P. falciparum. Les formes graves présentent une importante inflammation systémique associée à une accumulation locale des globules rouges parasités dans les organes profonds. En collaboration avec l'hôpital Korle-Bu (Dr. Goka) et l'Institut Noguchi au Ghana (Dr Akanmori) et le Rigshospitalet au Danemark (Dr. Hviid et Dr.Kurtzhals), nous avons entrepris une analyse détaillée des profils d'activation des lymphocytes T et des monocytes chez des enfants souffrant de paludisme simple, d'anémie grave ou de neuropaludisme. Nos résultats indiquent que la principale différence entre les deux formes graves se situe au niveau des lymphocytes T. En utilisant CytProQuant, une nouvelle technique RT-PCR en temps réel que nous avons développée pour permettre la quantification absolue des messagers de cytokines, nous avons mis en évidence des profils d'activation T différents dans l'anémie grave et le neuropaludisme.

Par ailleurs, nous étudions le rôle des lymphocytes T gamma delta dans le modèle d'infection par P. falciparum chez le singe Saimiri sciureus. Nos résultats indiquent que les lymphocytes T V gamma  jouent un rôle important dans la phase de clairance des parasites. Nous étudions actuellement le rôle fonctionnel de ces lymphocytes in vitro et in vivo.

2. Facteurs parasitaires de pathogénicité (S.Bonnefoy, P.Buffet, P.David, M.Diez Silva, M.Guillotte, O.Natalang, I.Vigan)

Nous utilisons une approche de manipulation génétique de Plasmodium falciparum dans l'étude de la virulence dans le modèle d'infection expérimentale du singe Saïmiri sciureus. Les souches plasmodiales qui induisent une infection létale présentent des caractéristiques particulières, parmi lesquelles une délétion du gène resa et la présence d'un allèle particulier du locus hrp1. Ces deux gènes codent pour des protéines localisées dans la membrane des hématies infectées et interagissent avec d'autres protéines parasitaires et le cytosquelette érythrocytaire. Pour analyser la contribution de ces facteurs à la pathologie palustre, nous avons procédé dans un premier temps à l'invalidation du gène resa de la souche avirulente FUP/CB. La perte d'expression de la protéine correspondante, sans effet notable sur la croissance parasitaire in vitro, entraîne cependant une modification du profil d'infection in vivo en augmentant la parasitémie moyenne chez tous les singes infectés. La mise au point des outils génétiques nécessaires à la mutagenèse séquentielle, est actuellement mise à profit pour l'étude de la contribution du gène hrpI à la pathologie. D'autres outils moléculaires, tels que des systèmes de sélection positive/négative sont en cours de développement au laboratoire.

Deux facteurs parasitaires potentiellement impliqués dans la virulence sont explorés . L'adhésine varO est exposée à la surface du globule rouge parasité, permettant la fixation des hématies saines (" rosetting ") ou parasitées (auto-agglutination). L'étude des propriétés d'adhésion a montré que la cytoadhérence médiée par varO correspond à un nouveau type de cytoadhérence. L'adhésine var O est composée de 6 domaines d'adhésion distincts. Nous avons entrepris de cloner et d'exprimer les différents domaines sous forme de protéine recombinante afin d'explorer la faisabilité d'une approche vaccinale ciblant des interactions dans le modèle d'infection chez le singe Saimiri. L'analyse des propriétés immunologiques de ces domaines est en cours.

Le second facteur étudié est RESA, une protéine déposée au moment de l'invasion dans la membrane du globule rouge, où elle interagit avec la spectrine. Afin d'explorer son rôle biologique, nous avons préparé des parasites dont le gène resa a été invalidé. Ces mutants nous ont permis d'établir que la perte d'expression de RESA, qui est sans effet notable sur la croissance parasitaire in vitro et ne modifie que légèrement le profil d'infection in vivo chez le singe Saimiri, a des conséquences importantes dans la réponse au choc thermique. La protéine RESA s'avère essentielle au maintien de l'intégrité de la membrane érythrocytaire après un choc thermique (voir figure). Le rôle biologique de RESA est de modifier le cytosquelette de sa cellule hôte pour lui permettre de résister aux effets délétères des élévations de température lors des accès fébriles.

Par ailleurs, nous cherchons à identifier de nouveaux facteurs de parasitaire de virulence par une exploration du transcriptome parasitaire. Une plate-forme d'exploration du transcriptome de P.falciparum par puces à ADN a été établie avec la Génopole (PT2, J-Y Coppée). L'étude de parasites provenant de patients infectés par P.falciparum, effectuée dans le cadre du programme de recherche clinique GLOBEX, mené avec le Centre Médical de l'Institut Pasteur et les services d'urgence de plusieurs hôpitaux parisiens, a pour objectif d'identifier les gènes spécifiquement activés in vivo. Ceux-ci pourraient contribuer à la virulence et à une meilleure adaptation des parasites à leur hôte. En parallèle à cette utilisation des puces à ADN dans l'étude des facteurs de pathogénicité, nous coordonnons l'exploitation de cette plate-forme dans le cadre des projets de recherche de 15 laboratoires français travaillant sur différents aspects de la biologie de P.falciparum.

3. Recours à un système d'organe isolé perfusé pour explorer la fonction de la rate au cours de l'infection par P.falciparum (P.Buffet, P.David , V. Brousse).

La rate joue un rôle majeur au cours de l'infection palustre, aussi bien dans l'élimination du parasite que dans la modulation du phénotype parasitaire. Nous avons entrepris un programme de recherche dont le but est d'explorer chez l'homme les fonctions spléniques en début d'infection, à un stade où elles pourraient conditionner l'orientation clinique. La première étape a été de mettre en place un système d'organe isolé perfusé permettant une survie de plusieurs heures de la rate ex vivo. Une étude préliminaire sur dix rates de porc ayant montré la faisabilité de ce projet, le système de perfusion ex vivo est à présent appliqué à des rates humaines prélevées chez des patients dans le cadre d'interventions sur des néoplasies gastriques ou pancréatiques. Ces rates sont perfusées avec des érythrocytes infectés par P.falciparum, permettant d'effectuer diverses explorations fonctionnelles et immuno-histochimiques (collaborations : G.Milon, U. d'Immunophysiologie et Parasitisme Intracellulaire. M.Huerre U. de Recherche et d'Expertise Histotechnologie et Pathologie).

4. Etude de la diversité parasitaire en zone d'endémie (O.Puijalon, MT Ekala, N. Noranate, M. Guillotte, H Jouin).

Le polymorphisme parasitaire est un paramètre important dans la relation hôte/parasite. Il contribue indéniablement à la survenue des accès et probablement à leur gravité. Nous avons mis en place un programme d'analyse du polymorphisme parasitaire par séquençage systématique qui nous permet de caractériser les populations parasitaires circulant dans le village de Dielmo au Sénégal. Nous avons aussi participé à l'analyse d'autres populations dans d'autres zones d'endémie. Nous coordonnons en particulier un programme multicentrique  d'analyse du polymorphisme parasitaire dans le cadre du Réseau des Instituts Pasteur [T. Fandeur (I.P. Cambodge), F. Ariey et M. Randrianarivelojosia (I.P. Madagascar), R. Jambou (I.P. Dakar) et E. Legrand (I.P. Guyane)], impliquant la Génopole (PT1 C. Bouchier). Nous y étudions la diversité allélique des populations parasitaires dans quatre zones géographiques distinctes. Ce programme a permis de décrire un nombre important de nouvelles mutations dans des loci cibles des anti-paludiques et un nombre très élevé d'allèles du locus msp1 bloc2. Nous avons étudié les conséquences immunologiques de cette diversité allélique dans le cas du locus msp1 bloc2 et montré une réponse immune biaisée en faveur d'une spécificité restreinte et de l'utilisation préférentielle de chaîne légère des Immunoglobulines.

Légende Figure. Les globules rouges infectés par les parasites exprimant RESA ne forment pas de vésicules et ne subissent pas de réduction de taille à la suite d'un bref traitement à 50°C (paneau en haut à droite) contrairement aux globules rouges infectés par les parasites n'exprimant plus RESA et aux globules rouges non infectés (paneau an bas à gauche). La protéine RESA est visualisée par une réaction verte consécutive à la fixation d'anticorps spécifiques détectés par l'AlexaFluor 488, les parasites sont visualisés par la coloration bleue de leur noyau par le Hoechst 33342.

Mots-clés: Paludisme, Pathologie, Lymphocytes, Diversité, Génétique Moléculaire


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