Unité: Immunophysiopathologie Infectieuse

Responsable: Pierre-André CAZENAVE

Les activités de recherche de l'Unité concernent l'immunophysiopathologie d'infections parasitaires : maladie de Chagas et paludisme en parallèle avec des études plus fondamentales portant sur les répertoires immuns de l'immunité adaptative et de l'immunité innée.

La TcPRAC proline racémase eucaryote mitogène relarguée par T. cruzi (P. Minoprio). Nous avons poursuivi l'analyse moléculaire, biochimique, fonctionnelle et structurale de la TcPRAC, la première proline racémase eucaryote, exprimée par le parasite Trypanosoma cruzi. Cette enzyme, intracellulaire chez les formes parasitaires non infectantes de l'insecte vecteur, est impliquée dans le mécanisme de différenciation du parasite vers des formes métacycliques infectantes pour l'hôte mammifère et donc dans l'acquisition de virulence par le parasite. L'isoforme TcPRACA est, par ailleurs, secrétée lors de l'infection et contribue à l'échappement du parasite aux réponses immunitaires par son activité mitogène pour les lymphocytes B de l'hôte. Les gènes codant pour la TcPRAC sont essentiels à la survie de T.cruzi, car les parasites portant une mutation fonctionnelle de TcPRAC ne sont pas viables. Nous avons montré par des études cristallographiques et fonctionnelles que l'enzyme possède deux sites actifs et que l'interaction de la proline racémase avec son inhibiteur catalytique induit un changement conformationnel de la protéine qui se traduit aussi par la perte de l'activité mitogènique. Par l'utilisation d'un microtest de détection des acides aminés D-, développé au laboratoire, et des plaques chirales, nous avons mis en évidence que les formes infectantes du parasite expriment des protéines contenant de la D-proline, ce qui contribuerait à l'évasion et la persistance du parasite chez l'hôte. Nos études portent actuellement sur l'identification de ces protéines, ainsi que d'un inhibiteur soluble de l'enzyme pour l'élaboration d'une stratégie immuno(chimio)thérapeutique.

Etude de la diversité et de la plasticité du Système Immunitaire (A. Six). Une activité importante du laboratoire concerne l'amélioration et la mise en œuvre de techniques d'exploration de la diversité et de la plasticité des répertoires des lymphocytes B et T caractérisés par leur récepteur spécifique d'antigène, immunoglobulines et TCR. En collaboration avec les groupes de S. Pied et P.A. Cazenave, ces techniques sont appliquées à l'étude de la modification des répertoires lymphocytaires en situations physiologiques ou pathologiques, notamment dans le cadre des projets d'étude de maladies infectieuses développés au laboratoire (leishmania, paludisme) chez l'homme et chez la souris. Nous avons continué à améliorer notre stratégie ISEApeaks en raffinant nos procédures expérimentales et développant de nouvelles représentations statistiques des répertoires. Nous poursuivons nos analyses de répertoire TCRBV dans des modèles expérimentaux de paludisme : protection contre l'infection par P.yoelii des souris C57BL/6 immunisées avec des sporozoites de P.yoelii irradiés; modèle de neuropaludisme chez les souris B10.D2 infectées par P.berghei. Nous explorons actuellement la perturbation des lymphocytes du cerveau de ces souris par comparaison aux lymphocytes de la rate et du sang afin d'identifier les clones pathogènes ou protecteurs. Parallèlement, en collaboration avec le groupe de Petter Höglund au Karolinska Institutet à Stockholm, nous avons étudié la diversité du TCR de la population de cellules T isolées des ganglions lymphatiques pancréatiques (PLN) de souris NOD. Nous avons observé une utilisation préférentielle apparente de TCRBV5.1 et TCRBV5.2 dans le PLN par rapport aux ganglions lymphatiques inguinaux. Une analyse moléculaire des segments TCRBV-BJ révèle quatre TCR candidats impliqués dans la phase initiale du développement du diabète autoimmun.

Rôle des TLR dans le développement et la fonction des cellules B (D. Rueff-Juy). Dans le but d'étudier le rôle des TLR dans le développement et la fonction des cellules B, nous avons recherché un éventuel polymorphisme des TLR ou des voies biochimiques en aval de ces récepteurs. L'étude de la réponse proliférative (incorporation de TH3 ou analyse par CFSE) des cellules B spléniques de 9 lignées de souris sauvages au LPS (TLR4) et au CpG (TLR9) nous a montré que 2 d'entre elles étaient faiblement ou non répondeuses au LPS et/ou au CpG. Cependant, l'up-régulation du marqueur CD69 après 14 heures de culture en présence de LPS et de CpG suggère que TLR4 et 9 sont capables de transduire le signal d'activation initial. Les analyses par FACS montrent un profil anormal des marqueurs CD21/CD23/CD1d/CD9 suggérant une absence de zone marginale splénique conventionnelle chez ces souris. Cette présomption est confortée par l'observation d'une désorganisation de la pulpe blanche révélée lors d'un marquage histologique avec des anticorps anti-IgM et MOMA-1. De façon surprenante, les cellules B cultivées en présence de LPS ou de CpG produisent des quantités d'anticorps de type IgM comparables à celles produites par les cellules B de souris de laboratoire. De plus, ces souris produisent des taux importants d'anticorps anti-phosphotylcholine. Des expériences sont en cours pour estimer la fonctionnalité de ces anticorps dans des tests de protection et pour rechercher les bases moléculaires du défaut de prolifération de cellules B de ces souris au LPS et/ou au CpG. Des analyses par FACS du phénotype des cellules péritonéales révèlent que la population de cellules B1a présente chez toutes les souris de laboratoires est absente chez 22 souris sauvages. Cependant, ces souris présentent une nouvelle population caractérisée par le phénotype B220hi CD5- Mac1+. Les souris F1 issues du croisement de souris de laboratoire et de souris sauvages montrent la présence de populations B1a et Bw, suggérant que cette population est indépendante de la population B1a. Des expériences de transfert de cellules de la moelle osseuse ou du foie fœtal dans différents receveurs sont en cours afin de déterminer l'origine et l'influence de l'environnement sur l'engagement de cette nouvelle population jusqu'à présent non décrite.

Réponses immunes associées à l'immunophysiopathologie du paludisme (S. Pied). Les travaux menés sur l'immunophysiopathologie du paludisme portent sur l'identification des réponses protectrices et pathologiques résultant d'une infection par Plasmodium ainsi que leurs influences mutuelles. Ces études sont menées en parallèle dans des modèles expérimentaux murins infectés par P. berghei ANKA (réponses pathologiques) ou P. yoelii (réponses protectrices) et chez l'homme infecté par P. falciparum manifestant différentes formes cliniques de la maladie allant du paludisme asymptomatique au neuropaludisme.

Etude des réponses des cellules NKT et NK induites au cours de la primo-infection par des sporozoïtes de P. yoelii (S. Pied, J. Roland). Nous avons observé que la réponse des cellules NKT à la primo-infection par des sporozoïtes de P. yoelii est hétérogène et compartimentée. Différentes sous-populations de cellules NKT sont activées et leur effectif augmenté dans le foie et la rate au cours de l'infection. Elles sécrètent de l'IFN-γ, une cytokine de type Th1 ayant une activité anti-parasitaire. Les cellules NKT hépatiques produisent l'IFN-γtrès tôt durant l'infection et sembleraient ainsi être impliquées dans l'inhibition du développement des formes intra-hépatiques du parasite in vitro. Elles joueraient ainsi un rôle dans le contrôle des stades précoces du parasite mais également dans l'orientation de la réponse immune adaptative vers un profil Th1 favorisant la mise en place de mécanismes protecteurs. A l'opposé, les cellules NKT de la rate sécrètent l'IFN-γplus tardivement au cours de l'infection et participeraient donc au contrôle des stades érythrocytaires. Néanmoins, les cellules NKT ne sont pas indispensables à l'élimination du parasite, puisque les souris ne possédant pas ces populations de lymphocytes contrôlent l'infection aussi bien que les souris témoins. La population de cellules NK évolue différemment dans la rate et le foie au cours de l'infection par P. yoelii. Leur nombre augmente dans le foie alors qu'il diminue dans la rate. Le répertoire des molécules Ly49 qu'ils expriment n'est pas modifié dans le foie alors qu'il l'est dans la rate. Leur activité cytotoxique ainsi que leur sécrétion d'IFNγ augmentent dans le foie alors que ces deux activités restent à leur niveau basal dans la rate. Des études in vitro et in vivo suggèrent que les cellules NK du foie participeraient au contrôle du développement parasitaire dans la phase précoce de l'infection. Une étude réalisée dans le cadre du Grand Programme Horizontal " Anophèle " a permis de montrer le rôle immunosuppresseur de la salive sur ces réponses immunes induites par Plasmodium.

Etude des réponses pathologiques associées aux manifestations neurologiques dans le modèle d'infection par P. berghei ANKA (S. Pied, P.A. Cazenave). Nous avons précédemment montré que le développement du neuropaludisme chez la souris C57BL/6 est associé à une migration sélective de lymphocytes T CD8+ producteurs de TNF-α ou d'IFN-γ et caractérisés par un répertoire TCRVβ restreint. Nous avons émis l'hypothèse que cette réponse T CD8+ impliquée dans le développement du neuropaludisme pourrait être en partie due à un défaut de contrôle par les cellules TCD4+ régulatrices. Nos résultats montrent que les cellules T CD4+CD25high Foxp3+ productrices d'IL-10 sont augmentées et activées durant l'infection par P. berghei ANKA. Bien qu'elles soient capables de supprimer in vitro la prolifération de cellules TCD4 ou CD8 provenant de souris saines ou infectées et stimulées par de l'anti-CD3, elles ne semblent pas contrôler in vivo la réponse CD8 pathogénique. De plus, la déplétion des cellules T CD4+CD25+ régulatrice n'a aucun effet sur la survenue du neuropaludisme.

Etude des mécanismes impliqués dans la genèse du neuropaludisme au cours d'une infection à P. falciparum (S. Pied). Nous avons entrepris une étude globale de la réactivité des IgG plasmatiques contre des antigènes de cerveau humain chez des patients ayant développé une infection à P. falciparum asymptomatique, non compliquée ou sévère avec ou sans atteinte neurologique. Cette étude a été réalisée en utilisant la méthode de PANAMA-BLOT (permettant l'analyse simultanée de milliers d'antigènes) couplée à une analyse statistique multiparamétrique. Les résultats obtenus montrent une production d'auto-anticorps dirigés contre des antigènes du cerveau humain significativement plus élevée chez les neuropaludéens et les patients développant une infection asymptomatique par rapport aux accès palustres non compliqués et sévères sans atteinte neurologique. Ces réactivités dirigées contre un groupe d'antigènes de haut poids moléculaire sont corrélées à des concentrations plasmatiques de TNFα élevées chez les neuropaludéens et à de fort taux d'IL-10 chez les porteurs asymptomatiques. Ces résultats suggèrent fortement une association entre auto-réactivité et gravité du paludisme.

Déterminisme génétique de la résistance à des formes graves du paludisme expérimental à P. berghei ANKA (P.A Cazenave, S. Pied). Nous avons montré l'association du phénotype de résistance au neuropaludisme à deux régions localisées respectivement sur les chromosomes 1 et 11. Au cours de cette étude, un phénotype inattendu et inconnu de résistance à la mort par hyperparasitémie a été découvert et nous avons montré son association à trois régions respectivement sur les chromosomes 1,4 et 9. Des souris C57BL/6 congéniques soit pour la région du chomosome 1, soit pour celle du chomosome 11 viennent d'être obtenues, nous disposerons dans peu de temps de la congénique au chomosome 9 et de la double congénique aux chomosomes 1 et 11 (collaboration avec le laboratoire du Prof.D. Holmberg, Université d'Umea, Suède).

Un nouveau modèle murin de sensibilité à la leishmaniose cutanée (L.major) (P.A Cazenave). Nous avons montré que les souris appartenant à la lignée PWK sont sensibles à la leishmaniose cutanée à L. major. Elles développent une forme de la maladie qu'elles contrôlent, celle-ci étant caractérisée par une réponse immune présentant un profil mixte Th1/Th2 où l'IL-10 joue un rôle décisif aggravant. Elles acquièrent aussi une résistance à une seconde infection. Ces caractéristiques sont proches de celles observées chez l'homme infecté par L. major. Cette lignée de souris apparaît ainsi comme un modèle de choix pour la pathologie humaine. Une étude génétique a été entamée à la suite de l'observation d'une résistance des individus F1 résultant des croisements PWK x BALB/c, montrant que les gènes de sensibilité PWK et BALB/c sont différents (collaboration étroite avec les laboratoires des Pr. K. Dellagi et H. Louzir, Institut Pasteur de Tunis, dans le cadre d'un PTR).

Mots-clés: Système immunitaire, immunophysiopathologie, répertoires T et B, maladie de Chagas, paludisme, mitogène, neuropaludisme, TLR


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