Unité: Immunité anti-virale, Biothérapie et Vaccins

Responsable: GOUGEON Marie-Lise

Notre activité de recherche est centrée sur l'étude de la diversité des répertoires des lymphocytes T et B et sur les fonctions de diverses sous-populations lymphocytaires dans des situations physiologiques et pathologiques (cancers, maladies infectieuses, maladies autoimmunes). Par ailleurs, nous nous intéressons aux interactions entre le VIH et le système immunitaire de l'hôte, notamment aux stratégies développées par le VIH pour échapper à la réponse immune.

1- Caractérisation des sous-populations de lymphocytes T de mémoire " centrale " et " effectrice " (Cecile Bouneaud, Zacarias Garcia et Christophe Pannetier)

Bien qu'il soit généralement accepté qu'on puisse subdiviser la population T mémoire en deux compartiments appelés mémoire " centrale " (TCM) et " effectrice " (TEM), les voies de différenciation de ces deux sous-populations sont encore mal connues, de même que leurs relations de filiation éventuelle. Dans un modèle murin permettant d'étudier les cellules CD8 TCM et TEM spécifiques du peptide mâle Smcy3 présenté par H2-Db, nous avons étudié le répertoire TCRa des deux sous-populations mémoires, dans différents organes lymphoïdes et après restimulation antigénique. Les études de répertoire montrent que deux tiers des clones TCM et TEM dérivent d'un précurseur commun naïf, alors que le dernier tiers est distinct. De plus, les deux populations TCM et TEM montrent des comportements très différents in vivo : les clones TCM sont stables en absence de re-stimulation, mais ils répondent fortement à un challenge antigénique et ils se différencient à la fois en TCM et TEM, bien que seule une partie des TCM génère des TEM.; au contraire, les TEM ne persistent pas longtemps en absence d'antigène et ils ne sont pas capables de générer une réponse proliférative secondaire après challenge antigénique. Ces résultats révèlent que les deux populations TCM et TEM ont des comportements drastiquement différents, et suggèrent que la qualité plutôt que la quantité de cellules mémoires doit être prise en compte, notamment dans les essais d'immunisation vaccinale chez l'homme.

2- Détection de lymphocytes T CD4+ humains spécifiques d'antigène de très faible fréquence après sélection à l'aide de billes tétramère-MHC class II et analyse Immunoscope (Fabrice Lemaitre, Manuelle Viguier).

Les tétramères MHC-class II représentent des outils importants pour l'étude des réponses T CD4 dans différentes situations cliniques chez l'homme. Nous avons produit des molécules HLA-DRA1*0101/DRB1*0401 solubles et non chargées en peptide en utilisant des cellules de Drosophila melanogaster. Des expériences de chargement de peptide nous ont permis de démontrer que ces molécules recombinantes sont capables de présenter des antigènes de façon aussi efficaces que les molécules natives. Cependant les fréquences de cellules détectables par ces molécules au sein de PBMC (1/700) sont bien inférieures à celles obtenues habituellement avec les tétramères CMH-I ou détectables avec des techniques telles que l'ELISPOT. Pour augmenter la sensibilité de notre approche, nous avons adapté une technologie mise au point dans le laboratoire pour les tétramères de CMH classe I, en combinant l'utilisation de billes magnétiques coatées avec des molécules de CMH-II pour trier les cellules T CD4 spécifiques d'un antigène donné, et la technologie Immunoscope permettant de traquer les cellules portant un réarrangement de TCR donné. Cette combinaison nous a permis de diminuer grandement le seuil de détection de cellules T CD4 spécifiques au sein de PBMC (jusqu'à 4x10-6) et est d'un grand intérêt dans le cadre de l'immunomonitorage de patients lors d'essais cliniques, pour le suivi de populations cellulaires CD4 spécifiques d'antigènes tumoraux, viraux ou d'autoantigènes.

3- Influence de l'activité enzymatique de la Terminale déoxynucléotidyl Transférase (TdT) sur les répertoires V-alpha et V-beta publics (Nicolas Fazilleau, Fabrice Lemaitre, Jean Kanellopoulos)

L'enzyme TdT catalyse l'addition de nucléotides aux extrémités codantes des segments de gènes du TCR. Dans le but de quantifier la contribution de cette enzyme sur la diversité des TCR, nous avons estimé la taille du répertoire des cellules Tab chez des souris TdTko. Les rates de souris naïves contiennent environ 105 TCR distincts à un moment donné, ce qui correspond à 5-10 % de la taille du répertoire T calculée chez les souris de génotype sauvage. La TdT est à l'origine d'au moins 90 % de la diversité du TCRab. Lors d'une réponse lymphocytaire T contre un complexe CMH-peptide, les lymphocytes T spécifiques portent des TCR publics dont les réarrangements Va-Ja et/ou Vb-Db-Jb sont communs à tous les individus d'un même haplotype. Les réarrangements publics Va-Ja et Vb-Db-Jb spécifiques de trois épitopes antigéniques sont identiques chez les souris TdTko et sauvages, et les séquences des CDR3 publics des souris TdT+/+ et TdTko présentent de fortes homologies entre elles. Par ailleurs, malgré la baisse de diversité de 15 à 20 fois chez les souris TdTko, une maturation d'avidité des réponses T secondaires est observée. Nos résultats suggèrent donc que les répertoires T publics sont majoritairement indépendants de la TdT.

4- Immunoscope et suivi clinique (Annick Lim, Brigitte Lemercier, Xavier Wertz, François Huetz)

Depuis sa conception (1992), l'Immunoscope a été amélioré sans relâche, afin de le rendre apte au suivi clinique des réponses T chez l'homme, dans diverses situations pathologiques, ou dans des essais d'immunothérapie. Parmi les additions les plus importantes qui ont été réalisées figurent : (a) l'inclusion des méthodes réellement quantitatives ; (b) l'adjonction d'un module de séquençage à haut débit ; (c) la combinaison de l'Immunoscope et du tri de cellules T spécifiques grâce à des tétramères de molécules HLA de classe I chargés avec des peptides définis ; (d) la définition de protocoles adaptés à un suivi clinique prospectif et rétrospectif. Le développement récent de l'Immunoscope pour les cellules B étend le champ d'intervention de cette technologie à d'autres situations cliniques et au suivi d'essais vaccinaux.

5- Rôle des T régulatrices dans le mélanome métastasique (Manuelle Viguier, Fabrice Lemaitre, Laurent Ferradini).

Les réponses immunologiques aux tumeurs restent mal comprises. En particulier, on ne retrouve pas de corrélation stricte entre les régressions tumorales et le développement de réponses T cytolytiques spécifiques de la tumeur, que ce soit dans le cas de mélanomes ou d'autres cancers généralement moins bien documentés au plan immunologique. La description récente de cellules T régulatrices (Treg) CD4+CD25+ et leur rôle dans le maintien de la tolérance et le contrôle de l'autoimmunité nous a incités à tester l'hypothèse selon laquelle des Treg supprimeraient la réponse des lymphocytes T inflitrant un mélanome humain métastasique. Nous avons montré que les T CD4+CD25+ sont sur-représentés dans les ganglions métastasiques, elles expriment Foxp3, le marqueur des Treg, et elles ont un phénotype activé et un répertoire TCR Vß polyclonal, analysé par Immunoscope. Ces cellules inhibent in vitro la prolifération et la production de cytokines de cellules T CD8+ et T CD4+CD25- au travers d'un mécanisme contact-dépendant. Les Treg représentent donc un élément important du microenvironnement suppresseur des mélanomes métastasiques, et pourraient contribuer à la mauvaise réponse de certains patients à des protocoles d'immunothérapie. Contrebalancer l'effet de ces cellules pourrait représenter de nouvelles stratégies anti-tumorales.

6- Influence de l'immunothérapie par l'IL-2 sur la dynamique des cellules T CD4 et les fonctions antivirales des T CD8 chez des patients VIH+ (Béatrice Poirier-Baudoin, Peggy Masdehors-Taoui, Valérie Seffer, Sylvie Rouyre, en collaboration avec le Pr. Yves Levy, Hôpital Henri Mondor, Créteil)

La combinaison de molécules antirétovirales inhibant la trancriptase inverse et la protéase du VIH s'avère efficace chez une fraction importante de patients chroniquement infectés par le VIH, induisant une suppression de la charge virale plasmatique et une restauration du nombre de lymphocytes T CD4. Cependant ces traitements sont limités par leur toxicité, responsable de complications métaboliques sévères. Dans le but de promouvoir la restauration quantitative et qualitative du pool des lymphocytes T CD4, ces traitements ont été associés à une immunothérapie par l'IL-2, cytokine immunostimulante jouant un rôle central dans l'induction et le maintien d'une immunité antivirale. Afin de comprendre les mécanismes homéostasiques qui contribuent à la restauration immune chez les patients recevant de l'IL-2, nous avons développé différentes approches permettant de détecter ex-vivo des cellules récemment produites par le thymus (TREC), d'identifier des cellules subissant soit une prolifération homéostatique soit une mort programmée par apoptose. En parallèle, l'immunité antivirale a été analysée par une analyse multiparamétrique en cytométrie de flux après stimulation par des antigènes viraux. Dans le cadre de trois essais cliniques (ANRS 048, ANRS 079, Silcaat), nous avons ainsi montré que la dynamique des lymphocytes T CD4 est modifiée sous l'effet de l'IL-2, notamment en agissant sur leur survie et en induisant leur expansion périphérique, et l'immunothérapie par l'IL-2 permet de maintenir sur le long terme des cellules effectrices spécifiques du VIH.

7- Circuits lymphocytaires responsables du " homing " des lymphocytes T dans la muqueuse digestive (Delphine Guy-Grand, en collaboration avec Pierre Vassali).

La muqueuse digestive est peuplée par 4 types de lymphocytes T: les lymphocytes TCRb CD4+ ou CD8ab+ (type a), les lymphocytes TCRb sans co-récepteurs ou CD8aa+, et les lymphocytes TCRgd (type b). L'expression de l'intégrine, a4b7, est responsable du tropisme dans la muqueuse des lymphocytes circulants de type a. Dans la lymphe du canal thoracique circulent les précurseurs des 4 populations de lymphocytes muqueux. La lymphe renferme 2,5% de lymphocytes a4b7, répartis dans toutes les sous-populations. L'étude des thymocytes et de la lymphe des souris thymectomisées à l'âge adulte permet de montrer que l'expression d'a4b7 peut être acquise dans des localisations différentes par les lymphocytes de type a (dans le territoire lymphoïde associé à l'intestin) et de type b (sur les thymocytes). La fraction de lymphocytes muqueux qui recircule dans la lymphe est faite en majorité de lymphocytes mémoire de type central ou périphérique. Les lymphocytes de type effecteur (CD44+CD62L-) qui recirculent sont ceux qui sont les moins différenciés dans la voie cytotoxique. Chez les souris euthymiques, nous avons montré que toutes les populations étaient originaires du thymus. Ces lymphocytes activés sont constitués de cellules " mémoire " qui circulent à travers la lamina propria, et de cellules " effectrices ", qui ne circulent plus et acquièrent des fonctions lytiques de type NK. Les précurseurs T ne sont pas seuls à circuler dans la lymphe du canal thoracique pour se loger dans l'épithélium et/ou la lamina propria. Le petit contingent de cellules activées en division qui circule comprend également les précurseurs des plasmocytes, des mastocytes, exprimant a4b7, et de cellules dendritiques. Toutes ces cellules participent à des chaînes de réactions impliquées dans le maintien de l'intégrité épithéliale.

8- Dynamiques des réponses lymphocytaires T in vivo (Susanna Celli, Zacarias Garcia, Philippe Bousso).

L'activité de cette équipe s'articule autour de deux axes principaux : d'une part elle étudie la régulation des interactions entre lymphocytes T (LT) et cellules dendritiques (DC) in vivo, d'autre part elle analyse comment le programme d'activation des LT est déterminé par les caractéristiques des contacts avec les DC. Pour ce faire, des techniques d'imagerie statique et dynamique (microscopie confocale et multiphoton) sont utilisées afin d'analyser la migration lymphocytaire et les interactions cellulaires dans le ganglion lymphatique. Le rôle de certains paramètres (comme l'affinité du TCR, la densité d'antigène, le phénotype des LT…) est étudié ainsi que les caractéristiques (durée, stabilité, fréquence) des contacts LT-DC. Un système expérimental a été établi qui permet de suivre l'historique des rencontres avec l'antigène de cellules T individuelles et les conséquences fonctionnelles d'interactions multiples avec les DC. Nous nous intéressons aussi aux dynamiques moléculaires lors des interactions LT-DC et notamment à la formation de la synapse immunologique in vivo. Nos objectifs consistent à déterminer i) si une telle structure existe in vivo, et ii) si tous types de contact permettant l'activation lymphocytaire génèrent le même profil de synapse immunologique. Enfin, nous utilisons des approches d'imagerie pour analyser les interactions cellulaires gouvernant, d'une part, l'aide fournie par les cellules T CD4 lors de réponses lymphocytaires cytotoxiques et, d'autre part, la suppression de réponses T par les cellules T régulatrices CD4+CD25+. Ces informations devraient nous permettre de mieux comprendre comment sont régulées les réponses lymphocytaires T in vivo.

9- Allergie au pollen de frêne : étude immunochimique (Pascal Poncet, en collaboration avec Gabriel Peltre, ESPCI, et Jean-Michel Wal, INRA)

Le frêne (Fraxinus excelsior) induit, du Nord au Sud de l'Europe à la fin de l'hiver, une pollinisation importante responsable de rhinites, conjonctivites et asthmes allergiques (70% des cas). Afin d'identifier les allergènes du pollen de frêne et pour déterminer le profil de sensibilisation de différents patients allergiques aux pollens, nous avons analysé par western blot mono- ou bi-dimensionnel le profil de réactivité des IgE sériques de 62 patients diagnostiqués pour une allergie au pollen de frêne, de troène, d'olivier, ou de graminées. Certaines protéines ont ensuite été identifiées par spectrométrie de masse. Nous montrons que 92% des patients allergiques au frêne ont des IgE reconnaissant Fra e 1, l'allergène majeur du frêne, et 46% reconnaissent la profiline. Les allergènes d'un extrait soluble de pollen de frêne peuvent se répartir en 5 zones en fonction de leur point isolélectrique, définissant ainsi l'allergome du pollen de frêne. La spectrométrie de masse a permis d'identifier 10 protéines non reconnues par les IgE des sérums qui ont permis de définir l'allergome du frêne. Ce travail contribue à une meilleure définition des allergènes du pollen de frêne et de la sensibilisation qu'ils induisent, et l'étude de la pertinence diagnostique et thérapeutique de chacun de ces composants peut avoir un impact sur la prédiction de l'évolution des symptômes des patients allergiques et sur l'élaboration d'un traitement (vaccination allergique).

Mots-clés: Répertoire TCR et BCR, Immunoscope, T régulatrices, mélanome, immunothérapie, SIDA


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