Unité: Génétique Moléculaire des Virus Respiratoires - URA 1966 CNRS

Responsable: van der WERF Sylvie

Les activités de l'unité sont centrées sur la génétique moléculaire des virus à ARN positif ou négatif (virus grippaux, coronavirus associé au SRAS, hépacivirus). Elles portent sur l'étude des mécanismes moléculaires de l'expression et de la réplication des génomes viraux et de leur emploi comme vecteurs d'expression, l'analyse des interactions fonctionnelles entre le virus et son hôte, l'épidémiologie moléculaire et l'étude de la variabilité des génomes viraux ainsi que le développement d'approches vaccinales et diagnostiques, notamment pour le SRAS-CoV.

I. "GÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE DES VIRUS RESPIRATOIRES" responsable Sylvie van der WERF

a) Génétique moléculaire des complexes de transcription/réplication des virus grippaux (Nadia NAFFAKH, Bernadette CRESCENZO-CHAIGNE, Emmanuel DOS-SANTOS, Pierre DUARTE-RODRIGUES, Monika MARASESCU)

Les séquences des extrémités des segments génomiques sont partiellement conservées pour les 3 types de virus grippaux A, B et C et constituent le promoteur pour l'initiation de la transcription et de la réplication par le complexe polymérase du virus. Nous avions montré précédemment à l'aide d'un système de transcription/réplication transitoire que la nature de certains nucléotides et la stabilité de la structure secondaire des extrémités des segments d'ARN viral sont des déterminants importants pour la reconaissance spécifique de type par le complexe polymérase. L'étude de l'effet de mutations de ces déterminants après introduction par génétique inverse dans le contexte d'un virus infectieux nous a permis de confirmer le rôle de ces déterminants pour la multiplication virale et de souligner l'importance de l'extrémité 5' pour la reconnaissance par le complexe polymérase.

Dans le but de compléter notre étude sur les déterminants de spécificité d'espèce par comparaison des complexes polymérase issus de virus grippaux d'origine humaine et d'origine aviaire dans le contexte de cellules aviaires versus cellules de mammifères, nous avons réalisé le clonage du promoteur polI aviaire et développé un système de génétique inverse en cellules aviaires. Ce système nous permet d'entreprendre l'étude des interactions fonctionnelles du complexe polymérase avec les protéines cellulaires en cellules aviaires. Dans la perspective d'identifier les interacteurs cellulaires du complexe, nous avons poursuivi l'étude des virus grippaux exprimant une des sous-unités (PB2) du complexe polymérase sous forme taggée.

b) Emballage des segments d'ARN viral (Nicolas ESCRIOU, Nadia NAFFAKH, India LECLERCQ, Sylvie GERBAUD, Emmanuel DOS-SANTOS, Monika MARASESCU)

Par différentes approches nous avons confirmé l'importance de séquences chevauchant l'extrémité des séquences codantes pour la multiplication virale dans le cas des segments NA et PB2. A l'aide de pseudo-ARN viraux dérivés de ces segments et dirigeant l'expression de gènes rapporteurs nous avons établi que ces séquences jouent un rôle pour l'emballage des segments d'ARN au cours de l'étape de morphogenèse de la particule virale et cartographié plus précisément les signaux impliqués.

Virus grippaux transfectants à segment bicistronique comme vecteurs (Nicolas ESCRIOU, Sylvie GERBAUD)

Par génétique inverse, des virus grippaux transfectants à segment bicistronique comprenant un promoteur 3' interne avaient été obtenus, et leur capacité à se multiplier in vivo et à induire une réponse humorale ou T-cytotoxique vis-à-vis d'antigènes hétérologues établie. Nous avons poursuivi la généralisation de cette approche à l'expression d'autres séquences hétérologues (traceurs fluorescents, antigène HBs, NP du LCMV) ainsi qu'à d'autres segments du virus grippal.

d) Expression des protéines structurales du SRAS-CoV (Nicolas ESCRIOU, Benoît CALLENDRET, Valérie LORIN)

Après clonage des séquences correspondant aux différentes protéines structurales du coronavirus associé au SRAS, leur expression au moyen de différents vecteurs procaryotes et eucaryotes a été réalisée afin de produire les protéines recombinantes dans une perspective à visée vaccinale et/ou diagnostique. Une contribution à l'évaluation de modèles animaux d'infection par le SRAS-CoV a également été apportée.

e) Centre National de Référence du Virus Influenzae (Région Nord) et Centre collaborateur de l'OMS pour la référence et la recherche sur les virus grippaux et les autres virus respiratoires (Sylvie van der WERF, Jean-Claude MANUGUERRA, Jean-Thierry AUBIN, Ana-Maria BURGUIERE, Maryse TARDY-PANIT, Saliha AZEBI, Frédérique CUVELIER, Patricia JEANNIN, Valérie LORIN, Claudine ROUSSEAUX)

En tant que Centre de Référence, l'unité contribue à la surveillance des virus grippaux et d'autres virus respiratoires au niveau national par le biais du réseau de laboratoires hospitaliers RENAL et du réseau des GROG (Groupes Régionaux d'Observation de la Grippe), et au niveau international notamment européen, par échange télématique des données dans le cadre du groupe EISS (European Influenza Surveillance Scheme), et par l'animation du réseau EUROGROG.

L'isolement, l'identification, la caractérisation antigénique ainsi que la caractérisation génétique des virus respiratoires sont réalisés à partir des prélèvements de cas d'infections respiratoires de type syndrome grippal adressés au Centre. L'unité assure également la caractérisation antigénique et génétique des virus grippaux animaux isolés chez les porcs, les chevaux ou encore l'avifaune. Ces études par séquençage à large échelle devraient permettre l'analyse de l'évolution spatio-temporelle des virus grippaux humains et animaux (aviaires, équins, porcins) en relation avec la symptomatologie clinique et les caractéristiques phénotypiques des virus, ainsi que de la fréquence des réassortiments entre différents lignages de virus.

Dans le cadre des alertes liées à la survenue de cas humains d'infection par les virus grippaux aviaires H5N1 circulant en Asie, l'unité a fait partie du réseau de laboratoires de référence de l'OMS pour les virus H5. Nous avons notamment isolé et caractérisé des virus H5N1 de différentes espèces d'oiseaux qui nous ont été adressés par l'Institut Pasteur du Cambodge à Pnomh Penh. Des techniques de RT-PCR pour la détection spécifique de ces virus ont été développées et mises en œuvre pour l'évaluation de cas suspects en France.

II. "VIRUS des HÉPATITES", Responsable: Annette MARTIN

Etude in vitro et in vivo de différentes étapes du cycle viral des virus de l'hépatite C et GBV-B (Annette MARTIN, Lisette COHEN, David GHIBAUDO, Christophe CHEVALIER, Lucile WARTER)

L'étude du virus de l'hépatite C (VHC) est compliquée par l'absence de système cellulaire permettant la multiplication efficace de ce virus in vitro et de modèle animal autre que le chimpanzé. Le virus GBV-B est un modèle d'étude du VHC particulièrement intéressant : sur le plan génomique, le GBV-B est le virus le plus proche du VHC, il est responsable d'une hépatite chez de petits primates tels les tamarins et marmousets, et se multiplie efficacement dans des cultures d'hépatocytes primaires de ces espèces.

Nous nous intéressons aux protéines structurales de ces virus et avons montré qu'il est possible d'assembler la protéine de capside du GBV-B avec les protéines d'enveloppe du VHC en pseudo-particules virales, ouvrant la voie à la création de virus chimériques du GBV-B porteurs des protéines d'enveloppe, donc de l'antigénicité, du VHC. Après avoir identifié une nouvelle protéine p13 du GBV-B présentant des homologies partielles avec la protéine p7 du VHC, nous recherchons sa fonction potentielle comme canal ionique et tentons de clarifier le rôle de ces protéines dans le cycle infectieux de ces virus par une approche de génétique inverse.

Nous mettons au point et utilisons des ARN autoréplicatifs (réplicons) du VHC et du GBV-B afin d'étudier les mécanismes moléculaires du découpage de la polyprotéine virale et de la réplication de l'ARN viral dans des lignées cellulaires d'origine hépatocytaire. Ce modèle de réplicons du VHC nous a servi pour l'identification de petits ARN interférents (siRNA) ciblant un domaine impliqué dans l'initiation de la traduction par entrée interne des ribosomes (IRES) et capables d'inhiber la réplication de l'ARN du VHC en culture cellulaire (coll. Labo. Enterovirus et Stratégies Antivirales, I.P.). Nous pouvons désormais éprouver in vitro et in vivo chez le petit primate le potentiel antiviral de ces siRNA en utilisant le virus GBV-B chimérique porteur du domaine du VHC ciblé que nous avons obtenu.

Mots-clés: grippe, hépatite C, coronavirus associé au SRAS, réplication, assemblage, vaccin, vecteur, virologie, épidémiologie moléculaire, modèle animal


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