Unité: Génétique Moléculaire Murine - URA CNRS 2578

Responsable: Philip AVNER

L'activité de l'unité est organisée autour de trois thématiques :

1) L'Epigénétique : l'inactivation du chromosome X chez la souris.

2) La Génétique : l'analyse du diabète de type 1 chez la souris comme modèle pour des caractères sous contrôle multifactoriel et polygénique.

3) Les cellules souches : le rôle du gène Nap1l2, lié au chromosome X, dans le contrôle de la division cellulaire des cellules neuronales et la prolifération des cellules souches neuronales.

1) L'inactivation du chromosome X

L'inactivation du chromosome X, phénomène biologique extrêmement complexe, qui est l'un des paradigmes pour les processus sous contrôle épigénetique, est l'une des préoccupations majeures de l'Unité de Génétique Moléculaire Murine.

L'initiation de l'inactivation, qui dépend du locus Xic (X-inactivation centre), inclut un processus qui permet le comptage du nombre de chromosomes X par rapport au nombre d'autosomes dans des cellules embryonnaires, siège de la mise en place de l'inactivation. Ceci aboutit à ce que dans une cellule diploïde somatique porteuse de plusieurs chromosomes X, seul un chromosome X reste actif, tous les autres sont inactivés. Le processus d'inactivation dépend de la présence du gène Xist qui assure la présence d'un ARN non-codant qui décore l'X inactif. L'étude moléculaire de Xic le laisse apparaître, de plus en plus clairement, comme un complexe d'éléments distincts associés à Xist et capable d'assurer les étapes précoces de l'inactivation. Si plusieurs loci, incluant le locus Xce (X-controlling element), sont connus pour affecter le choix ou la probabilité que l'un ou l'autre des chromosomes X soit inactivé, peu de choses sont connues sur les éléments impliqués dans le comptage.

Nous avons, en 2004, poursuivi la caractérisation fonctionnelle des éléments en 3' de Xist, au sein du Xic, par une double approche basée d'un côté, sur la mutagenèse ciblée conditionnelle en utilisant le système Cre-lox et de l'autre, sur une stratégie de complémentation de délétions préexistantes. Des mutations ont été obtenues à la fois dans les lignées ES femelle, permettant l'analyse du choix et dans des lignées ES mâle, permettant l'analyse du phénomène de comptage. En effet, une mutation dans le système de comptage peut se manifester dans des cellules mâles par l'inactivation " totalement illégitime " du chromosome X en l'absence d'un deuxième chromosome X, équivalent à une mise à mort de la cellule. Cette double approche a permis des progrès continus dans notre compréhension des éléments génétiques mis en jeu dans le comptage, le choix et dans la régulation de Xist. Ainsi, des travaux récents sur l'antisens à Xist, Tsix ont permis d'éclairer le mécanisme d'action de ce dernier. En particulier, nous avons pu montré que Tsix agit sur la transcription de Xist plutôt de facon indirecte en influencant l'ouverture de la chromatine et, en particulier, celle de la région promotrice de Xist. Une étude de la conservation à travers l'évolution du Xic, par séquencage et annotation comparée de sept espèces de mammifères, actuellement entreprise en collaboration avec le Genoscope et Laurent Duret (Université de Lyon), devrait nous aider à décortiquer le rôle et l'importance des éléments génétiques au sein du Xic.

Nous avons continué et consolidé nos analyses de la partie du Xic en 5' de Xist commencé il y a un an. Cette région a été définie par des expériences de ChIP (Chromatin Immunoprecipitation) et de cytologie, comme un centre éventuel de nucléation permettant à l'inactivation de s'étendre le long du chromosome X à partir du Xic dans les toutes premières étapes de l'inactivation. Des éléments particuliers, révélés par des expériences de ChIP, ont été soumis à une analyse par déletion et modification génétique et ce matériel sera analysé in vivo et ex vivo.

Enfin, notre intérêt dans des facteurs génétiques situés hors du Xic et, vraisemblablement, en dehors du chromosome X, impliqués dans le processus d'inactivation, s'est recentré sur des gènes impliqués dans le métabolisme des ARNs ou ayant des différences d'expression dans les embryons femelles et les embryons mâles de 6,5 jours post-coïtum décelé, dans une analyse SAGE effectuée en laboratoire (Serial Analysis of Gene Expression). Nous avons utilisé une approche du RNAi avec des vecteurs permettant une expression stable pour démontrer de façon définitive le rôle de certaines de ces séquences dans la mise en place et/ou le maintien de l'inactivation du chromosome X.

Recherche sur les génomes et les modèles murins des maladies humaines

2) L'analyse du diabète de type 1 chez la souris

L'Unité de Génétique Moléculaire Murine a entrepris d'utiliser la souris comme modèle pour l'étude des phénotypes sous contrôle polygénique et multifactoriel. La lignée NOD représente un modèle de diabète insulino-dépendant et son étude vise à définir les facteurs génétiques impliqués dans le développement de cette pathologie (Idd) qui est connue pour dépendre, à la fois, de facteurs génétiques et liés à l'environnement. Nos études sont concentrées sur la caractérisation de loci de contrôle situés sur la partie distale du chromosome 6 murin. Nous avons pu consolidé des progrès importants enregistrés l'année dernière dans l'affinement de la localisation génétique du locus Idd6, ainsi que dans la recherche de gènes candidats dans la région candidate ainsi définie pour Idd6. La caractérisation immunologique des lignées congéniques et, en particulier, les expériences de transfert cellulaire, ont facilité la définition du site d'action d'Idd6 ainsi que la recherche du gène candidat par l'analyse transcriptionnelle et mutationnelle. Les tests fonctionnels des cinq gènes candidats ainsi définis sont actuellement entrepris en utilisant une approche de RNAi medié par les vecteurs lentivirales.

3) Le rôle du gène Nap1l2

Une autre maladie sous contrôle génétique complexe et sujette à des effets environnementaux importants est le spina bifida - maladie congénitale liée à l'absence de fermeture complète du tube neural au cours de l'embryogénèse. Parmi les gènes impliqués, nous avons pu mettre en évidence le gène Nap1l2 lié au chromosome X. Des mutations dans ce gène chez la souris sont associées à une léthalité embryonnaire, spina bifida et exencéphalie. L'absence de fermeture complète du tube neural est fort probablement liée à la surprolifération des tissus neuronaux ainsi induits. Nous avons récemment introduit des mutations conditionnelles dans le gène Nap1l2 dans des lignées de cellules ES. Ces cellules ont été ensuite exploitées pour l'analyse ex vivo du gène Nap1l2 et pour établir des lignées de souris transgéniques pour la mutation. Ces lignées permettront, dans les prochains mois, de définir le rôle et les mécanismes d'action de Nap1l2 chez des souris adultes. L'établissement d'un système de différentiation efficace des cellules ES en cellules souches neuronales a, d'autre part, ouvert des perspectives pour l'étude détaillée des interactions et du rôle de Nap1l2 dans les cellules souches neuronales. Les cellules ainsi fournies ont été exploitées pour l'analyse d'expression par puce d'ADN et pour les études de biochimie approfondie.

Mots-clés: Epigénétique, Inactivation du chromosome X, Chromatine, Génétique, Génomique, Diabète de type 1, Souris, QTL, Caractère sous contrôle multigénique, Cellules souches


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