Unité: Génétique Moléculaire du Développement

Responsable: Margaret BUCKINGHAM

Nos recherches sont centrées d'une part sur l'étude de la myogenèse dans le but de comprendre comment les cellules progénitrices sont spécifiées chez l'embryon pour permettre la mise en place de différentes masses musculaires du squelette. Nous sommes également intéressés par les cellules progénitrices du muscle chez l'adulte et l'éventuelle contribution de cellules souches à la régénération. D'autre part, nous étudions la cardiogenèse avec l'analyse des différentes populations précurseurs du myocarde et leur contribution à la morphogenèse du cœur. Le modèle expérimental est la souris, manipulée par les approches de génétique moléculaire.

La formation du muscle de squelette

Les gènes Myf5 et Mrf4, ainsi que Pax3 et son paralogue Pax7, se situent en haut de la hiérarchie génétique qui détermine l'entrée d'une cellule dans la voie de différenciation musculaire. Myf5 et Mrf4 font partie de la famille de facteurs de régulation myogénique (Myf5, Mrf4, MyoD, Myogénine) à motif b-HLH, tandis que Pax3 appartient à la famille des facteurs de transcription à boîte homéo, les Pax, dont différents membres jouent un rôle clé dans l'organogenèse et l'apparition de cellules spécialisées, pendant le développement.

La régulation du locus Mrf4/Myf5

[Lola Bajard, Ted Chang, Philippe Daubas, Didier Rocancourt, P. Zammit (Londres)]

Nous étudions la régulation du locus Mrf4/Myf5 dans le but de comprendre comment ces gènes de détermination myogénique sont activés chez l'embryon. Par une approche transgénique, nous avons mis en évidence différentes régions, allant jusqu'à -96 kb en amont de Myf5 qui contrôlent l'expression spatio-temporelle du gène. En particulier, une séquence située entre -58/-48 kb est composée de plusieurs éléments qui ciblent spécifiquement les sites de transcription de Myf5 dans les somites et les membres ainsi que dans les régions du système nerveux central où la protéine n'est pas détectable. Nous avons caractérisé l'élément responsable pour l'expression de Myf5 dans les membres et identifié une molécule candidate qui le régule.

Un autre élément de régulation à -17 kb de Myf5 dirige une expression dans le myotome intercalé ou dans le muscle fœtal suivant la présence du promoteur Mrf4 ou Myf5. Cette régulation promoteur dépendante, constatée chez l'embryo, est aussi frappante chez l'adulte avec une expression dans les cellules satellites ou dans les fibres musculaires, respectivement.

Le fonctionnement de Pax3, par rapport à Pax7

[Mounia Lagha, Didier Montarras, Frédéric Relaix, Didier Rocancourt, Ahmed Mansouri (Göttingen)]

En l'absence de Pax3 plusieurs masses musculaires font défaut, dont celles des membres. Les dérivés de la crête neurale sont également atteints. Le ciblage du gène Pax3 par le gène rapporteur nlacZ et plus récemment GFP, nous a permis de suivre les cellules qui expriment le gène. Pax7, le paralogue de Pax3, est exprimé dans une sous-population de cellules Pax3+ chez l'embryon. Pour comparer les fonctions de Pax7 par rapport à Pax3 nous avons introduit la séquence codante de Pax7 dans le gène Pax3, accompagnée d'un gène rapporteur (IRES-nlacZ).Nous constatons que toutes les fonctions de Pax3 dans le tronc, aussi bien au niveau de la crête neurale que du muscle, sont remplacées par Pax7. Par contre, il y a des défauts de formation des muscles des membres quand Pax7 est exprimé à la place de Pax3 (Figure 1). Il s'agit de problèmes de migration et de réplication des cellules progénitrices provenant des somites. Sur le plan de l'évolution, il est intéressant de constater que chez un céphalochordé tel que Amphioxus, il n'y a qu'un seul gène Pax3/7 qui est exprimé dans les somites. Nous proposons que Pax3 a acquis les fonctions particulières requises pour le développement des membres pendant la radiation des tétrapodes.

Dans le muscle adulte Pax7 est exprimé dans les cellules progénitrices appelées cellules satellites. Chez le mutant Pax7-/- ces cellules sont absentes et il a été proposé que Pax7 est nécessaire pour leur spécification. Nous démontrons que les cellules satellites sont présentes chez le nouveau-né, mais que, en l'absence de Pax7, elle meurent progressivement. Pax3 est également exprimé dans une sous-population de cellules satellites. Tandis que Pax3, de même que Pax7, joue un rôle dans le déclanchement du programme myogénique dans ces cellules, Pax7 a une activité anti-apoptotique unique chez l'adulte.

La régulation du gène d'actine cardiaque

[Marguerite Lemonnier, Sigolène Meilhac, Susanna Molinari, Frédéric Relaix (en collaboration avec B. Schaeffer (Zurich)]

L'actine cardiaque est exprimée dans le muscle du squelette et dans certaines cellules du muscle lisse chez l'embryon aussi bien que dans le muscle cardiaque. Nous avons identifié les séquences activatrices en amont du gène, dont une régulée par Mef2 qui dirige l'expression spécifiquement dans le myocarde chez l'embryon et l'adulte. L'activité d'une autre séquence qui cible le muscle du squelette, dépend des facteurs de régulation myogénique et d'un complexe formé entre Mef2D, l'histone transacétylase CBP/p300 et une protéine Emb de la famille des facteurs de transcription à domaine Pou. Ce complexe, ainsi que le rôle des isoformes de Emb dans le muscle, sont intéressants dans le contexte de la régulation du locus au niveau de la chromatine.

Le gène d'actine cardiaque a été ciblé avec le rapporteur nlaacZ, dont un événement rare de recombinaison intragénique donne une séquence fonctionnelle nlacZ. Les souris qui portent l'allèle nlacZ ont été un outil précieux pour les études d'analyse clonale rétrospective des différents types de muscle dans lesquels l'actine cardiaque s'exprime.

Les cellules souches-mésoangioblastes et l'aorte dorsale

[Milan Esner, Sigolène Meilhac (collaborations avec Giulio Cossu (Milan), Ana Cumano (IP) et Jean-François Nicolas (IP)]

Plusieurs sources de cellules souches qui peuvent peupler le muscle ont été proposées, parmi lesquelles les mésoangioblastes provenant des parois de vaisseaux sanguins sont particulièrement intéressants. Nous étudions ces cellules qui expriment Pax3. Pendant l'embryogenèse, elles apparaissent d'abord dans l'aorte dorsale qui est également une source de cellules souches hématopoiétiques. Nous étudions les liens éventuels entre ces deux types de cellules souches.

Dans le contexte des mésoangioblastes, nous avons effectué une étude de lignage entre les cellules de l'aorte dorsale et du myotome, le premier muscle de squelette qui se forme dans les somites. Les souris avec le gène d'actine-cardiaque ciblé par le rapporteur nlaacZ ont permis une analyse clonale rétrospective qui révèle que les cellules de l'aorte dorsale et les cellules du myotome sont dérivées de cellules progénitrices communes. La plupart de ces cellules, dispersées dans la paroi de l'aorte dorsale, expriment les marqueurs du muscle lisse, mais quelques rares cellules endothéliales sont également présentes dans les clones. Leur présence fourni la preuve d'un progéniteur vasculaire commun.

Cardiogenèse

[Fanny Bajolle, Milan Esner, Sigolène Meilhac, Emmanuel Pecnard, Stéphane Zaffran (collaborations principalement avec Nigel Brown (Londres), Robert Kelly (New York) et Jean-François Nicolas (IP)]

Nous avons démontré, chez la souris, l'existence d'un deuxième champs cardiaque, situé dans le mésoderme pharyngé et source de cellules qui contribuent au myocarde du pôle artériel du cœur. Cette découverte dépendait d'abord des observations sur les lignées de souris transgéniques et du suivi de cellules marquées par injection DiI. Plus récemment, l'analyse clonale rétrospective des cellules du myocarde, avec les souris actine-cardiaquenlaacZ+, à E8.5, a permis de distinguer deux lignages de cellules du myocarde. Les deux contribuent à toutes les parties du cœur, sauf dans le cas du premier à la voie efférente, et dans le cas du deuxième au futur ventricule gauche. Ces résultats indiquent que la contribution du deuxième champ cardiaque est plus large et s'étend au ventricule droit et au pôle véneux. Une autre approche expérimentale a également mis en évidence la différence entre la formation des deux ventricules. Les cultures d'explants du mésoderme pharyngé ou du tube cardiaque, provenant des souris transgéniques qui marquent les différentes parties du cœur, démontrent que la plupart du tube primitif cardiaque a une identité ‘'ventricule gauche''. Les cellules précurseurs du ventricule droit aussi bien que de la voie efférente, se trouvent dans le mésoderme pharyngé. Ces résultats sont appuyés par les expériences de marquage par DiI chez les embryons en culture.

L'analyse clonale rétrospective a aussi permis de charactériser le comportement des cellules progénitrices du myocarde. Après une première phase de croissance dispersive, les cellules du myocarde, à E10.5 et déjà à E8.5, montrent une croissance cohérente et orientée (Figure 2). Il s'agit des premiers exemples de croissance orientée chez les vertébrés, qui préfigure la forme des différents compartiments du cœur.

L'analyse des clones dans la voie efférente du cœur à différents stades du développement fournit des aperçus intéressants sur une régionalisation dorsale/ventrale qui est également indiquée par certains marqueurs transgéniques. Ces outils nous permettent aussi de mettre en évidence une rotation de cette région du cœur, confirmée par le suivi de cellules marquées par DiI. Ce phénomène a des conséquences importantes pour l'alignement des gros vaisseaux et l'interprétation de l'origine des malformations congénitales de cette région du cœur.

Légendes des photos :

Figure 1: L'expression de β-galactosidase à E12.5 dans un embryon Pax3Pax7-IRESnLac/+ montre un développement normal des muscles dans le tronc (A) et membre antérieur (C), en présence d'un allèle fonctionnel de Pax3. Par contre dans un embryon Pax3Pax7-IRESnLacZ/Sp dépourvu d'allèle Pax3 actif et avec un allèle de Pax7 qui remplace un allèle de Pax3, les muscles du tronc sont normaux (B), mais ceux du membre antérieur sont absents (D).

Figure 2: Les amas de cellules β-galactosidase positives, dans le ventricule droit d'un cœur de souris α-actine cardiaquenLaacZ/+ à E10.5 démontrent une croissance orientée qui converge sur un point central (*) et s'étend vers l'extérieur du ventricule qui est en expansion.

Mots-clés: Myogenèse, Pax3, Pax7, Myf5, Cardiogenèse, Lignages Cellulaires


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