Unité: Génétique des Interactions Macromoléculaires

Responsable: Jacquier Alain

Nous étudions divers aspects du métabolisme des ARN chez la levure Saccharomyces cerevisiae utilisée comme modèle de cellule eucaryote. Durant l'année 2004 notre travail a en particulier porté sur : 1) la recherche exhaustive des petits ARN nucléolaires qui spécifient les sites de pseudouridylation dans l'ARNr, 2) l'étude de la voie de maturation et d'export des particules ribosomiques et en particulier l'assemblage des complexes pré-60S.

La thématique générale du laboratoire est focalisée sur certaines étapes du métabolisme des ARN chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Ces voies métaboliques regroupent de nombreuses étapes qui vont de la transcription de ces molécules dans le noyau, jusqu'à leur dégradation dans le cytoplasme en passant par les étapes de maturation ainsi que le transport nucléocytoplasmique. Nous employons une démarche de type globale au départ, pour aboutir à une analyse spécifique de certains facteurs au final. Pour cela, nous utilisons différentes techniques génériques comme le double-hybride (ou le triple-hybride ARN), les purifications biochimiques par affinité (TAP) et des cribles génétiques (cribles de co-létalité par exemple) afin d'identifier la fonction de nouveaux facteurs impliqués dans ces voies métaboliques. La combinaison de ces trois approches génériques nous permet de cerner l'étape dans laquelle sont impliqués ces facteurs. Nous faisons alors une analyse classique de ces candidats en réalisant des tests fonctionnels spécifiques de l'étape identifiée afin d'affiner leur caractérisation.

Recherche exhaustive chez la levure des petits ARN nucléolaires qui spécifient les sites de pseudouridylation dans l'ARNr.

Au cours de leur maturation, les ARN ribosomaux (ARNr) sont modifiés de façon covalente. La conversion des uridines en pseudo-uridines (Ψs) est l'une des modifications de l'ARN ribosomique les plus fréquentes. Chez les eucaryotes, les sites de pseudouridylation sont spécifiés par l'appariement de séquences de ciblage spécifiques que l'on trouve dans une classe particulière de petits ARN nucléolaires, les snoRNA à boites H/ACA. L'ARNr de levure contient 44 Ψs, mais, quand nous avons débuté ce travail, on ignorait les snoRNA spécifiant 15 de ces sites. Cela suggérait qu'il restait un nombre important de snoRNA H/ACA à identifier. Pour aborder cette question, nous avons entrepris l'identification exhaustive des ARN associés aux protéines Gar1p et Nhp2p qui sont spécifiques des snoRNA H/ACA. Ceci a été réalisé en couplant une méthode de purification par double affinité (méthode TAP) et l'hybridation des ARN associés aux complexes purifiés sur des puces à ADN génomiques. De manière inattendue, alors que nous avons ainsi identifié tous les snoRNAs H/ACA précédemment connus, nous n'avons identifié que trois nouveaux snoRNA. Cela suggérait que les ARN guides manquants étaient majoritairement présents dans les snoRNA déjà connus, mais que ceux-ci n'avaient été qu'imparfaitement caractérisés. Nous avons confirmé cette hypothèse en investiguant de manière systématique le rôle des snoRNA, précédemment connus ou nouveaux, dans la modification des pseudouridines des ARNr. Ceci nous a permis d'identifier les snoRNA impliqués dans chacune des pseudouridylations de l'ARNr chez la levure. On peut donc maintenant affirmer que les 44 Ψs des ARNr sont spécifiées par 28 snoRNA. Enfin, mis à part snR30, tous les snoRNA H/ACA de levure sont impliqués dans la pseudouridylation de l'ARNr (article soumis).

L'assemblage des complexes préribosomiques

La biogenèse des ribosomes est assurée au sein de très larges complexes dépassant le méga-Dalton. Nous avons récemment participé à la caractérisation de plusieurs macrocomplexes de composition protéique différente, qui jalonnent la voie de biogenèse de la grande sous-unité ribosomique (60S) chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Actuellement, nous disposons d'une liste relativement exhaustive des facteurs préribosomiques associés de manière stable à ces différentes particules qui se succèdent (pour revue Fromont-Racine et al., 2003).

Notre projet a pour but de comprendre les mécanismes qui régissent la dynamique d'assemblage des ribosomes. Pour cela, il est important (i) de caractériser les complexes successifs (approche de type protéomique) et (ii) de déterminer le rôle de certains facteurs clé de la biogenèse (analyse fonctionnelle ciblée).

(i) Nous purifions les complexes pré-ribosomiques par deux étapes de chromatographie d'affinité en tandem (TAP). La difficulté réside dans le fait qu'un facteur donné appartient le plus souvent à plusieurs complexes distincts. Afin de purifier des complexes aussi homogènes que possible, nous exprimons la protéine appât dans des mutants où la voie de maturation est bloquée à une étape précise ; le complexe pré-60S précédant cette étape se trouve ainsi fortement enrichi dans les cellules mutantes, au détriment des complexes situés plus en aval dans la biogenèse.

Pour comparer les complexes successifs, nous utilisons la technique SILAC, qui permet une quantification relative des protéines en spectrométrie de masse en mesurant les rapports d'intensité des peptides marqués in vivo à la leucine deutérée pour le mutant par rapport aux mêmes peptides non marqués dans le sauvage de référence.

Nous avons ainsi établi des groupes de facteurs pré-ribosomiques précoces ou tardifs. Nous affinons actuellement cette étude en appliquant cette approche à un choix plus vaste de mutants, agissant à différentes étapes de la maturation de la grande sous-unité ribosomique.

(ii) Nous cherchons à caractériser fonctionnellement plusieurs facteurs impliqués à des étapes clé de la biogenèse de la sous-unité 60S : Mak11, intervenant dans les étapes les plus précoces, Nsa2, qui se situe dans les étapes centrales, et Rei1, qui participe aux étapes les plus tardives.

- Lors de la caractérisation de complexes pré-ribosomiques pré-60S dans des conditions ou les étapes tardives de biogenèse sont bloquées, nous avons observé que Mak11 est un facteur précoce qui semble s'associer de manière transitoire. Ce facteur est lié génétiquement à Rlp24 et présent dans un complexe de petite taille. Ce petit complexe ainsi que l'interdépendance de Mak11 et Rlp24 est en cours de caractérisation.

- Le facteur pré-60S Nsa2 est impliqué, en partenariat avec la GTPase Nog1, dans le clivage de l'ITS2. Ce clivage semble être un point crucial pour la régulation de toute la voie de biogenèse de la grande sous-unité ribosomique. En effet, un grand nombre de mutations portant sur cette voie se traduisent, entre autres, par des défauts de maturation à ce niveau. Nous avons pu montrer que Nsa2 était essentiel à cette étape ; par ailleurs, les quantités cellulaires de ce facteur sont étroitement régulées, et dépendent du bon fonctionnement de l'ensemble de la voie métabolique. Ces caractéristiques font de Nsa2 un candidat de choix pour exercer un rôle de censeur de l'avancement de la biogenèse.

- Nous souhaitons caractériser les événements moléculaires qui marquent la fin de la biogenèse et la transition vers la traduction. Un petit nombre de facteurs pré-ribosomiques est présent au sein de complexes pré-60S très tardifs, localisés dans le cytoplasme ; parmi eux, en plus de Rlp24 que nous avons identifié précédemment, on trouve Arx1, Nmd3, Lsg1 et Rei1. Nous avons pu mettre en évidence des liens génétiques entre certains de ces facteurs. Par ailleurs, le rôle d'une importine dans le ré-import d'un facteur pré-ribosomique a pu être mis en évidence. Nous poursuivons l'analyse fonctionnelle de ces complexes tardifs, ainsi que celle des liens avec le recyclage des facteurs pré-ribosomiques.

Mots-clés: ARN, Saccharomyces cerevisiae, snoRNA, nucléole, ribosome


Rapports d'activité 2004 - Institut Pasteur
filet

Debut de Page recherche Portail Institut Pasteur

En cas de problèmes, de remarques, ou de questions concernant cette page Web écrire à rescom@pasteur.fr