Unité: Génétique Mycobactérienne

Responsable: Brigitte GICQUEL

Causée par les mycobactéries du complexe tuberculosis, la tuberculose continue de poser un problème majeur de santé publique : elle est responsable d'environ trois millions de morts par an. Le BCG, seul vaccin disponible actuellement contre cette maladie, est d'une efficacité relative. Quant à l'utilisation des antibiotiques, elle se heurte à l'apparition de souches résistantes. Dans ce contexte, l'Unité de Génétique Mycobactérienne s'intéresse à la caractérisation des facteurs de virulence de Mycobacterium tuberculosis et aux réponses immunitaires induites par cette bactérie et le BCG. Ces études pourraient conduire à l'identification de cibles thérapeutiques pour de nouveaux agents antituberculeux, et de composants de la bactérie susceptibles d'entrer dans la composition de nouveaux vaccins, voire d'une souche atténuée plus efficace que le BCG. L'unité étudie également la possibilité d'utiliser des souches de BCG portant des gènes étrangers pour protéger contre d'autres maladies, telles que le SIDA. Enfin l'Unité identifie des marqueurs génétiques spécifiques de souches particulièrement épidémiques, en particulier celles qui sont responsables d'épidémies de tuberculose à bacilles multirésistants.

Le phosphatidylinositol (PI) et les produits qui en sont métaboliquement dérivés comme les phosphatidylinositol mannosides (PIM

Etude génétique des déterminants de la virulence Responsables:M. Jackson, O. Neyrolles, B. Gicquel

L'utilisation d'un vecteur thermosensible dérivé du plasmide de Mycobacterium fortuitum pAL5000 et contenant le marqueur de contre-sélection sacB (vecteur Ts/sacB) a permis de construire et d'isoler des mutants d'échange allélique et de transposition chez les mycobactéries du complexe de Mycobacterium tuberculosis. Grâce à l'outil Ts/sacB, une banque ordonnée de 4000 mutants a été obtenue par la technique de mutagénèse par transposition étiquetée ou "STM" ("signature-tagged transposon mutagenesis"), et criblée pour rechercher directement chez la souris des souches atténuées pour la virulence. Environ 4000 souches ont maintenant été criblées pour leur capacité à se multiplier dans les poumons de souris. 29 mutants atténués au total ont été sélectionnés et les mutations qu'ils portent ont été caractérisées. Douze des insertions différentes sont localisées dans un groupe de gènes impliqués dans la biosynthèse et le transport de lipides complexes de l'enveloppe de M. tuberculosis: les dimycocérosates de phtiocérol (DIM). Une étude portant sur le rôle de ces lipides dans la pathogénèse a révélé que la présence de DIM dans l'enveloppe de M. tuberculosis protège cette bactérie de l'action bactéricide des dérivés toxiques de l'azote produits par les macrophages activés et module la réponse immunitaire de l'hôte à l'infection. Nous nous intéressons également à d'autres mutants isolés par la technique STM, en particulier ceux présentant des déficiences dans des régulateurs transcriptionnels, dans la famille PE/PPE encore mal connue, et dans la synthèse d'autres composés lipidiques de l'enveloppe. En outre, nous avons construit par échange allélique des mutants de M. tuberculosis déficients dans la synthèse de lipides spécifiques aux espèces pathogènes de mycobactéries et présentant certaines similarités structurales avec les DIM. L'étude de ces mutants dans des modèles cellulaires et animaux nous a permis de mesurer la contribution de ces différents lipides à la pathogénicité de M. tuberculosis. Nous nous intéressons maintenant à la régulation de la synthèse de ces lipides.

Le rôle des composants mycobactériens est étudié dans le cadre de TB-VAC, un Projet Intégré de la Comission Européenne (www.tb-vac.org). Les aspect éthiques relatifs à cette étude font l'objet du projet TBETHICS de la Commission Européenne (www.tbethics.org) coordonné par le Pr Brigitte Gicquel.

Interactions entre M. tuberculosis et les phagocytes Responsables: O. Neyrolles, B. Gicquel

Afin de mieux comprendre les mécanismes du parasitisme des macrophages par M. tuberculosis, de nouvelles approches combinées de biologie cellulaire et de génomique fonctionnelle ont été développées au laboratoire. En particulier des banques de mutants de M. tuberculosis ont été criblées pour identifier des gènes mycobactériens impliqués dans la croissance intracellulaire et l'inhibition de la maturation de la vacuole mycobactérienne dans les macrophages. A partir d'une banque de transposition d'environ 1500 clones, une trentaine de mutants atténués dans leur capacité à parasiter les macrophages humains ont été isolés et caractérisés.

Par ailleurs, nous étudions les intéractions précoces entre les mycobactéries et les phagocytes humains. Nous avons ainsi montré récemment que M. tuberculosis, et d'autres bactéries du complexe "tuberculosis", utilise la lectine DC-SIGN pour entrer dans les cellules dendritiques humaines, et que le lipoarabinomannane (LAM), un lipoglycane abondant de la paroi mycobactérienne, est un ligand de DC-SIGN. Nous avons également montré que DC-SIGN est exprimé sur les cellules dendritiques pulmonaires humaines et nous avons pu détecter des antigènes mycobactériens dans des cellules dendritiques exprimant DC-SIGN dans des ganglions de patients tuberculeux, indiquant que les mycobactéries intéragissent probablement avec la lectine in vivo. Par ailleurs, nous avons caractérisé les déterminants moléculaires de l'intéraction entre M. tuberculosis et DC-SIGN et nous avons pu ainsi expliquer pourquoi DC-SIGN ne reconnaît que les mycobactéries du complexe "tuberculosis". Ce résultat indique que ces pathogènes ont probablement évolué récemment pour utiliser cette lectine. Les conséquences fonctionnelles de l'interaction entre DC-SIGN et les mycobactéries sont en cours d'étude, in vivo et in vitro.

Recherche de nouvelles cibles pour des médicaments anti-tuberculeux Responsables: M. Jackson, B. Gicquel

Le phosphatidylinositol (PI) et les produits qui en sont métaboliquement dérivés comme les phosphatidylinositol mannosides (PIM), le lipomannane (LM) et le lipoarabinomannane (LAM) sont des phospholipides/ lipoglycanes qui jouent un rôle important, tant dans la physiologie des mycobactéries que dans leurs intéractions avec l'hôte. La caractérisation des enzymes impliquées dans leur biosynthèse, en plus d'apporter des connaissances fondamentales sur la façon dont sont synthétisées ces molécules, pourrait permettre d'identifier des cibles pour le développement de nouveaux médicaments anti-tuberculeux.

Nous avons identifié chez Mycobacterium tuberculosis un groupe de cinq gènes potentiellement impliqués dans les étapes précoces de la synthèse des PIM. Les fonctions de deux de ces gènes, pimA (Rv2610c) et Rv2611c ont été analysées et nous avons pu montré qu'ils codent respectivement une mannosyltransferase et une acyltransférase impliquées dans la synthèse des phosphatidylinositol mono-mannosides di- et tri-acylés. PimA est apparue comme étant une enzyme essentielle et constitue donc une cible intéressante pour le développement de nouveaux médicaments anti-tuberculeux. En collaboration avec l'Unité de Biochimie Structurale de l'Institut Pasteur, nous avons entrepris de résoudre la structure tri-dimensionnelle de PimA. La résolution de la structure de cette protéine devrait en effet permettre le criblage virtuel (in silico) d'inhibiteurs de cette enzyme dont l'efficacité sera ensuite testée au laboratoire en utilisant les essais enzymatiques in vitro que nous avons développés pour PimA.

Dans une approche plus générale et afin d'identifier d'autres enzymes de M. tuberculosis impliquées dans la biosynthèse des PIM, LM et LAM, nous avons entrepris d'inactiver par recombinaison homologue plusieurs autres gènes codant des glycosyltransférases potentiellement impliquées dans la biosynthèse de ces molécules. D'autre part, nous avons également entrepris de cribler des banques de mutants de transposition de M. tuberculosis avec un anticorps monoclonal dirigé contre le LAM. Quinze mutants présentant une réactivité réduite à cet anticorps ont été isolés et sont en cours de caractérisation.

Epidémiologie moléculaire de la tuberculose Responsable :Brigitte Gicquel

Des marqueurs spécifiques de souches de M. tuberculosis davantage transmissibles et responsables d'épidémies, en particulier d'épidémies de tuberculose à bacilles multirésistants aux antibiotiques ont été recherchés en collaboration avec les équipes du réseau européen d'épidémiologie moléculaire de la tuberculose le Public Health Research Institute et les Instituts du réseau et Instituts associés. Des allèles particuliers des gènes de la famille mutT et ogt ont été identifiés chez les souches de génotype W-Beijing. D'autres allèles spécifiques de la famille Haarlem ont été identifiés. Ces résultats suggèrent que ces souches particulièrement adaptées à l'hôte ont évolué grâce à l'acquisition de mutations dans des gènes de réparation de l'ADN qui ont conduit à des phénotypes mutateurs vraisemblablement transitoires. Ces allèles spécifiques des souches W-Beijing peuvent être utilisés pour la mise au point de diagnostics moléculaires identifiant les différentes branches de la famille W. Beijing. D'une façon générale le typage moléculaire des souches du complexe tuberculosis est effectué dans plusieurs régions pour définir les types majeurs et étudier leurs transmission. Des marqueurs spécifiques de génotypes majeurs sont recherchés par séquençage d'une série de gènes, en particulier les gènes impliqués dans la réparation de l'ADN. Cette approche permet de définir des polymorphismes qui sont ensuite détectés par génotypage.

BCG et nouveaux vaccins Responsable :Nathalie Winter

Mycobactérium bovis BCG est le seul outil prophylactique disponible pour lutter contre la tuberculose. Bien que très largement administré dans le monde, les mécanismes immunitaires de la vaccination -partiellement efficace- sont mal définis. Nous nous intéressons à la compréhension de ces mécanismes. Le vaccin étant administré chez l'homme par voie intradermique, un modèle d'injection du BCG dans le derme auriculaire de la souris est utilisé. En utilisant une souche de BCG recombinant exprimant egfp, nous avons observé les cellules infectées par le BCG sur le site d'injection et dans le ganglion auriculaire drainant de 4 à 72 heures post-injection. Nous avons trouvé très peu de phagocytes mononuclés -macrophages, cellules dendritiques dermiques ou cellules de Langerhans- associées au BCG dans la peau et dans le ganglion drainant impliquant que ces cellules jouent un rôle mineur dans le transport du bacille vers l'organe lymphoide secondaire. Nous avons abservé que les neutrophiles qui sont recrutés très rapidement dans le derme capturent le BCG sans toutefois l éliminer. Des neutrophiles sont détectés dans des vaisseaux lymphatiques dermiques et envahissent le ganglion drainant par la capsule dès quatre heures post-injection.

Des neutrophiles marqués par des composés fluorescents rouge ou vert réinjectés dans l'oreille droite ou gauche de la même souris sont observés sous la capsule du ganglion ipsilatéral uniquement. Ces résulats démontrent pour la première fois, que les neutrophiles peuvent quitter le site inflammatoire pour migrer vers le ganglion drainant par voie lymphatique. A douze heures post-injection des neutrophiles sont détectés dans la zone T du ganglion suggérant que ces cellules jouent un rôle dans la mise en place de la réponse adaptative. Dans le ganglion, le BCG est majoritairement détecté dans des neutrophiles aux temps précoces après la vaccination. Ceci suggère fortement que les neutrophiles peuvent transporter les bacilles du site d'injection vers le ganglion, un rôle qui avait jusque là été réservé aux cellules mononuclées de type dendritique ou monocyte/macrophage

Les intéractions entre cellules dendritiques et M. tuberculosis ou BCG sont également étudiées in vitro dans le laboratoire et en collaboration avec d'autres partenaires (Prina et al., 2003). Nous avons ainsi récemment démontré le rôle immunomodulateur des molécules DIM dans la réponse inflammatoire des CD (Rousseau et al., 2004).

Le BCG représente également un vecteur attractif pour le développement de vaccins recombinants notamment contre le SIDA (Méderlé et al., 2003). L'intégration des cassettes d'expression dans le choromosome de BCG permet d'obtenir des souches génétiquement stables in vivo. Les vecteurs dérivés du mycobactériophage Ms6 s'intégrent dans des gènes tRNAala différents chez M. smegmatis et de BCG. Cette observation nous permet de construire de nouveaux vecteurs ciblant plusieurs loci du chromosome de BCG dans le but de construire des souches multi-recombinantes. De nouveaux promoteurs induits dans les cellules présentatrices d'antigènes sont également à l'étude.

Mots-clés: Mycobactérie, pathogénicité, virulence, tuberculose, epidémiologie, vaccin


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