Unité: Biodiversité des Bactéries pathogènes émergentes - U389 INSERM

Responsable: GRIMONT Patrick

L'Unité comprend des laboratoires de recherche, un Centre Collaborateur OMS, trois Centres Nationaux de Référence (CNR) et un Centre fournissant des services d'identification bactérienne dans les domaines clinique, vétérinaire et industriel. Tous les aspects de la taxonomie bactérienne sont développés en ayant pour objectif d'apporter une meilleure définition moléculaire et physiologique des espèces et de réaliser des outils nouveaux d'identification et de typage moléculaires. Nos méthodes sont appliquées à toutes sortes de bactéries, y compris des pathogènes émergents.

Taxonomie et génétique des populations (Sylvain Brisse, Francine Grimont, Monique Janvier, Patrick Grimont)

Notre Unité participe aux efforts internationaux pour définir l'espèce bactérienne sur des bases moléculaires et phylogénomiques. Le séquençage de plusieurs gènes communs est une piste à valider. Une approche bioinformatique est nécessaire. Un robot permettant de préparer 96 réactions de séquences simultanément est utilisé au laboratoire. L'étude par séquençage de gènes multiples de la structure taxonomique des Klebsiella, pathogènes nosocomiaux opportunistes, a été initiée. Une méthode MLST (séquençotypage multilocus), consistant à typer les souches par séquençage de portions internes de sept gènes de ménage, a été développée pour Klebsiella pneumoniae. Cette méthode permettra de définir la structure génétique de l'espèce K. pneumoniae et de caractériser les souches qui causent des infections hospitalières.

Nous avons été sollicités par plusieurs collègues (en France ou hors de France, à l'Université ou dans les hôpitaux ou des CNR) pour caractériser de nouvelles espèces par hybridation ADN-ADN ou par séquençage du gène rrs codant l'ARNr 16S. Nous avons ainsi participé à la description de Aeromonas simiae (collaboration avec Henri Monteil, Institut de Microbiologie, Strasbourg), Vibrio ponticus (collaboration avec Esperanza Garay, Universitat de Valencia), et d'espèces de Streptococcus du groupe D (collaboration avec Anne Bouvet, Hôtel Dieu, Paris). Des souches dégradant les hydrocarbures (collaboration avec J. Oudot, Muséum d'Histoire Naturelle) ou responsables de la corrosion de métaux (collaboration avec Corrodis) ont été caractérisées. Des outils d'identification ont été développés pour identifier les groupes phylogénétiques de Klebsiella et des méthodes moléculaires ont été utilisées pour étudier les populations de Burkholderia cepacia, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, et Agrobacterium spp..

La répétabilité et reproductibilité de la ribotypie et de son interprétation sur ordinateur ont été étudiées en comparant plusieurs logiciels. Les performances de Taxotron (développé dans l'Unité) ont été excellentes.

Serotypage moléculaire des Klebsiella (S. Brisse, P.A.D. Grimont)

Le typage capsulaire de souches de Klebsiella pneumoniae est la méthode de référence pour la caractérisation des souches, mais sa mise en œuvre est pénible et son interprétation est subjective du fait des nombreuses réactions croisées entre les 77 types capsulaires (K-types). De ce fait, la méthode est limitée à quelques centres capables de produire les sérums nécessaires, dans le monde. Pour surmonter ces limitations, une méthode moléculaire a été mise au point qui consiste en une amplification de la région cps (regroupant les gènes impliqués dans l'élaboration de l'antigène capsulaire) suivie d'une restriction avec l'endonucléase HincII (méthode cps PCR-RFLP). Au total, 97 profils distincts (C-patterns) ont été obtenus à partir de 224 souches représentant les 77 K-types connus. Les C-patterns de tout K-type étaient distincts des C-patterns de tous les autres K-types (sauf pour K22 et K37 qui sont apparentés). La nouvelle méthode (cps PCR-RFLP) permet la détermination du sérotype capsulaire (K-type) tout en étant plus facile et plus discriminante que le sérotypage capsulaire classique.

Centre Collaborateur OMS pour les Salmonella (Patrick Grimont, François-Xavier Weill et Martine Guibourdenche)

Le CCOMS-Salmonella tient à jour le schéma de White-Kauffmann-Le Minor qui décrit la formule antigénique de tous les sérotypes connus de Salmonella. De nouveaux sérotypes sont caractérisés chaque année. Il faut 190 sérums pour sérotyper toutes les souches de Salmonella. Environ 60 sont commercialisés. Les 130 autres sont fabriqués au CCOMS.

Le CCOMS entretient la collection de tous les sérotypes connus et de leurs variants. Le CCOMS a entrepris la caractérisation génétique des sérotypes (en particulier, séquençage des gènes de flagelline).

Centre National de Référence des Salmonella (François-Xavier Weill et Patrick Grimont)

Le CNR-Salm participe à la surveillance des salmonelloses en France en sérotypant complètement (avec 190 sérums) de 7000 à 10000 souches de Salmonella par an. Ces souches sont envoyées au CNR-Salm (accompagnées des renseignements épidémiologiques essentiels) sur une base volontaire par près de 1500 laboratoires d'analyses de biologie médicale (publics et privés). Le CNR collecte également les informations sur les souches dont le sérotype a été déterminé localement (15000 par an). Un système informatisé de surveillance et d'alerte des salmonelloses humaines mis au point au CNR permet de documenter les tendances spatiales et temporelles des principaux sérotypes de Salmonella et de détecter précocement toute augmentation anormale d'un sérotype aux niveaux national, régional ou départemental. Différents relevés épidémiologiques sont adressés chaque semaine à l'Institut de Veille Sanitaire (InVS). Dès la constatation d'une augmentation anormale d'un sérotype, un message d'alerte est envoyé. Toutes les souches de Salmonella enterica sérotype Typhi sont ribotypées (automate RiboPrinter). Le Centre effectue aussi la lysotypie de Salmonella sérotypes Typhi, Typhimurium, Paratyphi B, et Enteritidis et la caractérisation par électrophorèse en champ pulsé des divers sérotypes. Le CNR-Salm suit l'évolution de la résistance aux antibiotiques chez les Salmonella. Plus de mille souches tirées au sort parmi 15 sérotypes majeurs sont étudiées chaque année. Le CNR participe au Réseau européen Enter-Net. Le CNR étudie les mécanismes moléculaires impliqués dans l'émergence des résistances aux antibiotiques chez les Salmonella. Ainsi, en 2004, l'émergence des gènes codant les béta-lactamases à spectre élargi TEM-52, SHV-12-like, CTX-M-9, et CTX-M-15, ansi que le gène aac(3)-Id de résistance aux aminosides ont été publiés. L'épidémiologie de la multirésistance du sérotype Typhi au Vietnam a été étudiée (collaboration avec M. Scavizzi).

Centre National de Référence des Escherichia coli-Shigella (Francine Grimont et Patrick Grimont)

Le CNR-coli participe à la surveillance des shigelloses et des infections (colites hémorragiques et syndromes hémolytiques et urémiques) à Escherichia coli producteurs de shigatoxine. Près de 1000 souches de Shigella sont identifiées et sérotypées par an. La détection de plusieurs gènes de virulence de E. coli est effectuée ainsi que le sérotypage classique et la ribotypie de certaines souches. Le CNR effectue la détection d'anticorps anti-LPS en cas de suspicion de syndrome hémolytique et urémique. Une méthode de sérotypage moléculaire étudiant les gènes impliqués dans la spécificité somatique O (région rfb) et flagellaire H (gène fliC) mise au point dans l'Unité est utilisée. Le CNR collabore au réseau national de surveillance du syndrome hémolytique et urémique (SHU) chez les enfants de moins de 15 ans en France (avec l'Hôpital Robert Debré, l'Institut de Veille Sanitaire et le Réseau des Pédiatres Néphrologues). En 2004, 58 cas de SHU chez les enfants ont été confirmés par sérologie positive anti-O157 (54 cas), O145 (2 cas), O91 (un cas) et O55 (un cas). Dix souches ont été isolées et possédaient les gènes stx2 et eae. Un groupe de cas d'infection à E. coli O157 portant les gènes stx2 et eae, a été étudié dans le Bas-Rhin et les Vosges. Un fromage frais de chèvre a été incriminé. Les résultats du CNR ont permis aux autorités sanitaires d'empêcher une épidémie.

Un groupe de 180 souches de Shigella non agglutinables, reçues de divers pays (surtout d'Afrique et un peu d'Asie et d'Amérique du Sud) en 5 ans est en cours de caractérisation. Ces souches ont le même biotype, ribotype, et profils de restriction du gène de flagelline cryptique et de la région rfb (impliquée dans la spécificité O).

Centre National de Référence pour Corynebacterium diphtheriae (Patrick Grimont et Anne Le Flèche)

Le CNR-Cd confirme l'identification des Corynebacterium diphtheriae, C. ulcerans, et C. pseudotuberculosis, recherche le gène de la toxine diphtérique par amplification génique, et effectue le typage moléculaire des souches par ribotypie.

En 2004, 4 cas d'infection à C. ulcerans toxinogène, un à C. diphtheriae biotype mitis toxinogène, et un à C. pseudotuberculosis toxinogène répondaient à la nouvelle définition européenne et française de la diphtérie et ont dûs être déclarés à l'InVS. Dans 3/4 des infections à C. ulcerans, le patient était en contact avec un chien. Il a été prouvé dans un cas que le chien était colonisé au niveau nasal par la même souche qui infectait le malade (collaboration avec M-N Bachelier, CHG de Bourges). La souche de C. diphtheriae a été retrouvée dans la gorge d'un enfant vacciné de retour de Madagascar. La souche de C. pseudotuberculosis provient d'un cas d'adénite caséeuse. La proximité de chèvres est suspectée. L'essentiel des cas mondiaux a été rapporté en Australie.

Dans le cadre du réseau OMS-Europe ELWGD (European Laboratory Working Group on Diphtheria) et du réseau DIPNET (DG-SANCO), une base de donnée de ribotypes de C. diphtheriae a été construite après étude de 576 souches isolées dans de nombreux pays dont l'ancienne URSS. Ces souches se distribuent en 86 ribotypes. Le logiciel Taxotron a été choisi pour l'identification automatique des ribotypes. Une nomenclature internationale des ribotypes a été publiée.

Centre d'Identification Moléculaire des Bactéries (Anne Le Flèche et Patrick Grimont)

Le CIMB a été créé en 2000 pour identifier toutes sortes de bactéries par des méthodes moléculaires en première intention (séquençage du gène rrs ou rpoB, ribotypie automatisée, amplification génique). Les souches étudiées proviennent de laboratoires cliniques, vétérinaires, industriels ou de l'environnement. En 2004, parmi 832 souches étudiées par séquençage, 75% ont été identifiées à 228 espèces valides, 10% étaient proches d' espèces taxonomiquement mal délimitées, 14% formaient 85 espèces nouvelles et 1% représentait 6 genres nouveaux. Les souches non industrielles qui ne correspondent à aucune espèce décrite, sont inclues dans nos programmes de recherche taxonomique. Certaines observations cliniques originales ont été publiées avec nos correspondants.

Légende de la photo :

Antibiogramme d'une souche de Salmonella enterica sérotype Livingstone productrice de béta-lactamase à spectre élargi de type CTX-M-27. IMP, imipénème; AMC, amoxicilline-acide clavulanique; CRO, ceftriaxone; CAZ, ceftazidime; AMX, amoxicilline; TIC, ticarcilline; PIP, pipéracilline. On observe une synergie en bouchon de champagne entre AMC et CRO, et entre AMC et CAZ.

Mots-clés: Bactériologie, Taxonomie, Phylogénomique, Entérobactéries, Typage moléculaire, Identification, Génétique des populations


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