Unité: Défense innée et Inflammation - Inserm E336

Responsable: Chignard Michel

Nos travaux concernent la défense innée et l'inflammation au niveau pulmonaire et utilisent diverses approches in vitro ainsi que des modèles animaux. Dsans un contexte de pathologies infectieuses, nous étudions le rôle des cellules épithéliales respiratoires, des macrophages alvéolaires, des polynucléaires neutrophiles et des monocytes. Une attention plus spécifique est centrée sur certaines molécules comme les "Toll-like receptors" (TLR), le récepteur de l'urokinase (CD87), ou encore les phospholipases A2 (PLA2) sécrétées. (voir figure).

Les poumons sont le siège de différentes pathologies dans lesquelles les mécanismes de défense innée et d'inflammation interviennent de façon essentielle. Parmi celles-ci figurent des pathologies majeures telles que le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA), la broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO), la mucoviscidose, ou encore les pneumopathies infectieuses d'origine bactérienne, fongique ou virale. Le processus de défense innée est naturellement bénéfique, mais son exacerbation peut conduire à des états inflammatoires préjudiciables. C'est dans ce contexte que nos travaux se proposent d'apporter une meilleure connaissance qualitative et quantitative des mécanismes impliqués, et qui pourrait permettre de cibler les évènements favorisant la défense innée sans augmenter la composante inflammatoire.

Interactions cellulaires dans l'environnement aérien pulmonaire (Michel Chignard, Dominique Pidard et Mustapha Si-Tahar)

Au cours du cycle respiratoire, les espaces aériens sont exposés à une multitude de particules et de micro-organismes (bactéries, champignons, virus). Les cellules du système immunitaire identifient les éléments infectieux au moyen notamment des TLR. Le rôle de ces récepteurs dans la reconnaissance des pathogènes et de leurs produits par la cellule épithéliale pulmonaire n'est pas clairement établi. Les mécanismes d'altérations de l'immunité de l'hôte sous l'effet de l'infection virale sont également mal connus. Parmi les trois types de virus influenza (A, B, C), seuls les types A et B sont responsables des épidémies annuelles de grippe. Sur le plan fondamental, un récepteur appelé TLR3, spécifique des ARN-double brin (ARNdb) d'origine virale, a récemment été identifié. Les travaux s'intéressant à l'expression de ce récepteur se sont largement focalisés sur les leucocytes. Or, la cellule épithéliale pulmonaire constitue la cellule cible principale des virus respiratoires. Nous avons tout d'abord démontré par RT-PCR que TLR3 est constitutivement exprimé au niveau des cellules épithéliales alvéolaires et bronchiques humaines normales (A549, BEAS-2B, NT-1) et mucoviscidosique (CFT-2). Par ailleurs, nous avons établi que l'expression de ce récepteur est positivement régulée par son propre ligand, l'ARNdb, ainsi que par le virus de la grippe influenza (souche A/Scotland/20/74(H3N2)) mais pas par d'autres médiateurs inflammatoires tels que le tumor necrosis factor-α (TNFα) et l'interleukine (IL)-1α . Nous avons également détaillé le mécanisme de signalisation par lequel un ARNdb synthétique, le poly(I :C), ainsi que le virus influenza induisent l'activation de la cellule épithéliale pulmonaire. Cette signalisation cellulaire dépend de TLR3 et implique les mitogen-activated protein kinases (MAPK) et la phosphatidylinositol 3-kinase/Akt (PI3-K/Akt) ainsi que la molécule adaptatrice TRIF mais ne dépend pas en revanche de MyD88. Cette cascade d'évènements aboutit à l'activation des facteurs transcriptionnels NF-κB et IRF/ISRE et à la sécrétion de l'IL-8, de l'IL-6, de RANTES et de l'interféron-α et à l'augmentation de l'expression d'ICAM-1, un récepteur majeur de l'adhérence cellulaire.

Au cours d'un processus infectieux et inflammatoire pulmonaire, les protéinases libérées tant par les cellules de l'hôte (macrophages alvéolaires, polynucléaires neutrophiles, cellules épithéliales) que par des pathogènes bactériens (tel que Pseudomonas aeruginosa chez les patients mucoviscidosiques) jouent un rôle important comme effecteurs de l'immunité, mais aussi comme facteurs délétères dans diverses pathologies, telles que le SDRA ou la mucoviscidose. Un récepteur membranaire exprimé de façon ubiquiste dans le poumon, le récepteur de l'urokinase (uPAR/CD87), joue un rôle important dans la recrutement des cellules inflammatoires et dans la réparation tissulaire. Son activité est connue pour être régulée par des protéinases, positivement (expression d'un motif chimiotactique) ou négativement (perte de domaines fonctionnels d'adhérence cellulaire). Nous avons (i) analysé la capacité de protéinases leucocytaires, épithéliales et bactériennes de cliver CD87, (ii) établi pour chacune les sites de clivage (collaboration avec la Plate-forme de Protéomique), et (iii) commencé à analyser l'impact du clivage sur les fonctions du récepteur (adhérence cellulaire et chimiotactisme). Nous avons également montré que chez des patients atteint d'un SDRA, il existe, dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA), une forme soluble de CD87, dont la concentration va de paire avec la présence de protéinases leucocytaires, et qui pourrait être porteuse d'activités biologiques, qui restent à évaluer.

Deux modèles expérimentaux d'étude de la réponse innée pulmonaire au cours d'infections ont par ailleurs été réalisés chez la souris. Tout d'abord, une infection par Aspergillus fumigatus, un champignon responsable de l'aspergillose pulmonaire invasive (API) chez les patients immunodéprimés. Notre approche a été centrée sur l'analyse, au cours de la progression de l'API, de différents paramètres caractéristiques de la réponse innée, et en fonction de deux types d'immunosuppression: soit par corticothérapie, soit par chimiothérapie neutropéniante. A différents temps après l'induction de l'infection, les réponses de l'hôte ont été comparées en termes de survie, de production pulmonaire de cytokines pro- et anti-inflammatoires, d'afflux de cellules dans les espaces aériens, de lésions pulmonaires, de détresse respiratoire et de développement fongique. Nous avons observé qu'en fonction du type d'immunosuppression, la pathogénèse de l'API impliquait plus spécifiquement un rôle prédominant soit du développement fongique, soit de la réponse exacerbée et néfaste de l'hôte. Nous avons également montré que TLR2 jouait un rôle important dans la réponse immune vis-à-vis d'A. fumigatus. Ainsi, les macrophages alvéolaires des souris déficientes pour ce récepteur, produisent moins de cytokines et de chimiokines que ceux des animaux sauvages en réponse au champignon. Nous avons également mis en évidence qu'au cours de l'infection in vivo, la détresse respiratoire ainsi que la charge en pathogènes sont plus importantes chez les souris déficientes, et que leur survie est diminuée (collaboration avec l'unité des Aspergillus et celle de Recherche et d'Expertise Histotechnologie et Pathologie). Le second modèle a permis d'étudier la réponse de l'hôte à Pseudomonas aeruginosa. Les mêmes paramètres ont été étudiés et les résultats ont mis en évidence, dans ce type de pneumopathie, une absence de rôle du LPS, un facteur de virulense exprimé par ces bactéries, en terme de mort des animaux. Ainsi les souris déficientes pour TLR4, et également pour TLR2, ont une mortalité semblable à celle de souris sauvages. Toutefois, les synthèses de certaines cytokines sont effondrées alors que d'autres sont maintenues. Il apparaît que certains motifs exprimés par P. aeruginosa sont primordiaux pour sa reconnaissance par l'hôte et sont capables d'induire la synthèse de cytokines spécifiques qui sont bénéfiques pour combattre l'infection (collaboration avec l'unité de Recherche et d'Expertise Histotechnologie et Pathologie).

Mécanismes de régulation et rôles des phospholipases A2 dans les pathologies inflammatoires pulmonaires (Lhousseine Touqui)

Les PLA2 sont des enzymes qui hydrolysent les phospholipides membranaires en position sn-2, conduisant à la production de lysophospholipides et d'acides gras libres, en particulier de l'acide arachidonique (AA).

Ces enzymes constituent une vaste famille de protéines, parmi lesquelles on trouve les PLA2 intracellulaires, dont la PLA2 cytosolique (cPLA2) est la plus étudiée, et les PLA2 sécrétées (sPLA2). Chez les mammifères, celles-ci sont subdivisées en plusieurs types comprenant sPLA2-I, sPLA2-II, sPLA2-III, sPLA2-V et sPLA2-X. Parmi ces enzymes, la sPLA2-IIA joue un rôle majeur dans le développement des maladies inflammatoires. Nous avons montré que la sPLA2-IIA exerce un effet bactéricide vis-à-vis de Bacillus anthtracis, l'agent étiologique de l'anthrax. Cet effet anthracide s'exerce aussi bien sur les bacilles capsulés que non capsulés et est corrélé à la capacité de la sPLA2-IIA à hydrolyser les phospholipides de la membrane des bactéries. Cependant, la sPLA2-IIA n'a aucun effet sur les formes sporulées de la bactérie. Par ailleurs, une activité anthracide liée à la sPLA2-IIA a été mise en évidence dans les LBA humains et le surnageant de macrophages alvéolaires, qui représentent la source principale de la sPLA2-IIA dans les tissus pulmonaires. De manière intéressante, nous avons observé que l'expression de la sPLA2-IIA par les macrophages alvéolaires était inhibée par la toxine létale de B. anthracis. Les mécanismes moléculaires impliqués dans cette inhibition sont en cours d'élucidation.

L'AA est le précurseur des prostaglandines produites par la cyclooxygènase (COX), une enzyme ubiquiste qui existe dans les cellules sous deux formes, une forme constitutive ou COX-1 et une forme inductible ou COX-2. Des données de la littérature ont montré que les concentrations des métabolites de l'AA dans les LBA de patients souffrant de mucoviscidose sont plus élevées que celles observées chez des sujets sains. Par ailleurs, une libération accrue de l'AA a été observée in vitro dans des cellules épithéliales humaines portant la mutation Δ F508 de la protéine CFTR (cellules CFT-2) en comparaison avec des cellules épithéliales témoins (cellules NT-1). Nous avons montré une surproduction de la prostaglandine E2 (PGE2) et une induction de l'expression de la sPLA2-IIA dans les cellules CFT-2 plus élevée que celle observée dans les cellules NT-1, au cours de la stimulation par le LPS. Nos études ont également montré que le LPS induit chez les souris CFTR -/- une inflammation pulmonaire exacerbée, accompagnée d'une augmentation de l'expression de la sPLA2-IIA et de la production de PGE2 en comparaison avec les souris CFTR +/+. Enfin, nous avons mis en évidence l'existence d'un "cross-talk" entre le CFTR et la sPLA2-IIA dans les cellules épithéliales et montré que la mutation Δ F508 du canal CFTR conduisait à une surexpression de cette enzyme par un mécanisme dépendant de NF-κ B. Ces résultats pourraient expliquer l'augmentation de la production des eicosanoïdes et l'exacerbation de la réaction inflammatoire observée chez les patients atteints de mucoviscidose

Mots-clés: immunité innée/inflammation, infection, cellules épithéliales, leucocytes, Toll-like receptors, protéinases, phospholipases A2, CD87, pneumopathie, mucoviscidose


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