Unité: Cytokines et Inflammation

Responsable: Cavaillon Jean-Marc

Nous étudions les phases précoces de l'immunité innée et tout particulièrement les mécanismes d'induction des cytokines par les bactéries à Gram négatif ou positif et par leurs produits dérivés (ou "PAMPs" pour pathogen-associated molecular patterns). Alors que cette étape est indispensable pour la mise en place de la réponse anti-infectieuse, son exacerbation peut générer des effets délétères tels que ceux rencontrés lors du choc septique ou durant les syndromes d'inflammation systémique (SIRS). Par ailleurs, la réponse anti-inflammatoire qui est alors naturellement initiée peut entraîner une altération du statut immunologique (figure 1). C'est dans ce contexte que nous étudions la production des cytokines et leur l'implication dans diverses pathologies inflammatoires systémiques (sepsis, traumatologie, ischémie-reperfusion, mucoviscidose). La reprogrammation des leucocytes circulants, réminiscence du phénomène de tolérance aux endotoxines, pourrait être associée à la susceptibilité accrue de ces patients aux infections nosocomiales. L'analyse de la signalisation intracellulaire au sein des monocytes révèle de nombreuses modifications par rapport aux cellules de sujets sains.

Les thèmes abordés concernent autant la recherche fondamentale que la recherche biomédicale, cette dernière étant menée en collaboration avec plusieurs services hospitaliers de la région parisienne.

1- BASES MOLÉCULAIRES DE LA REPROGRAMMATION LEUCOCYTAIRE LORS D'UNE RÉACTION INFLAMMATOIRE SYSTÉMIQUE (M. Adib-Conquy)

Depuis la découverte au laboratoire (Muñoz et al. J. Clin. Invest. 1991, 88, 1747) de l'altération de la production de cytokines ex vivo par les monocytes de sujets sepsis, nous nous sommes intéressés au processus d'immunodépression associé au SIRS. Nous avons décrit un phénomène proche chez des patients après chirurgie (Cabié et al. Cytokine 1992, 4, 576) ou chez des patients réanimés après un arrêt cardiaque (Adrie et al. Circulation 2002, 106, 562). Nous avons étendu et précisé cette observation au niveau des neutrophiles (Marie et al. Blood 1998, 91, 3439) et des lymphocytes T (Muret et al. Shock 2000, 13, 169). Nous avons analysé les mécanismes moléculaires intracellulaires qui président à l'immunodépression observée chez les patients SIRS. Une diminution de la translocation du facteur nucléaire -κB (NF-κB), un déséquilibre entre les formes active (p65p50) et inactive (p50p50), et une très faible expression cytoplasmique de son inhibiteur (IκBα), ont été observés chez les patients sepsis (Adib-Conquy et al. Am. J. Respir. Crit Care Med. 2000, 162, 1877). La perturbation de l'expression de NFκB perdure plus de 10 jours chez des patients de traumatologie (Adib-Conquy et al. J. Leuk. Biol. 2001, 70, 30).

Au cours du SIRS d'origine non-infectieuse, l'immunodépression est attestée au niveau des cellules mononucléées par une forte altération de la production de tumor necrosis factor (TNF) en réponse au lipopolysaccharide (LPS) d'Escherichia coli et au motif CpG des ADN bactériens, ainsi que par une altération de la production d'interleukine-6 (IL-6) en réponse à l'IL-1 et au TNF. Néanmoins, il ne s'agit pas d'une altération globale puisque les cellules demeurent réactives à d'autres stimuli (germes tués de Staphylococcus aureus (HKSA) ou de Streptococcus pyogenes, et d'un ligand du Toll-like receptor 2 (TLR2)) et continuent à produire de l'interleukine-10 et de l'IL-1 receptor antagonist (IL-1ra) en réponse au LPS d'E. coli. Nous avons montré que l'expression normale de TLR-2 et celle réduite de TLR4 ne pouvaient pas à elles seules expliquer l'altération de la signalisation observée dans les cellules de sujets SIRS. En effet, contrairement à la voie TLR2, la voie TLR4 aboutissant à la production de TNF est altérée. Par contre, la signalisation via TLR4 aboutissant à la production d'IL-10 (activation de la p38 MAPK et du facteur de transcription Sp-1) est amplifiée dans les cellules de sujets SIRS (figure 2). Ce travail démontre que l'hyporéactivité leucocytaire n'est pas un phénomène universel, mais qu'elle dépend des voies d'activation utilisées, certaines pouvant être altérées, tandis que d'autres demeurent fonctionnelles, voire surexprimées (Adib-Conquy et al. Am. J. Respir. Crit Care Med. 2003, 168, 158).

Plus récemment nous avons montré chez les patients septiques que la production de TNF en réponse au Pam3CysSK4, un ligand spécifique de TLR2 était également réduite, alors que la réponse à des germes tués de E. coli, de S. aureus ou au muramyl dipeptide (MDP) était identique à celle obtenue avec des monocytes de sujets sains. Le MDP est reconnu par un récepteur intracellulaire, la molécule Nod2. Au cours du sepsis, l'expression monocytaire de l'ARNm de Nod2 n'est pas modifiée, ni celle de Nod1 le capteur intracellulaire du peptidoglycane des bactéries à Gram négatif. A l'inverse, la production d'IL-10 en réponse au LPS et à Pam3CysSK4 était augmentée tandis que celle induite par les bactéries entières était inchangée. Nous avons étudié différentes molécules qui régulent négativement la signalisation dépendante des récepteurs TLR. C'est ainsi que dans les monocytes des patients septiques, l'analyse par RT-PCR, n'a pas révélé de modification des ARNm de Tollip et de SOCS1. Par contre, nous avons montré une expression accrue des ARNm de SIGIRR et de MyD88s (figure 2). Pour étudier le SIRS d'origine non-infectieuse, nous avons inclus un groupe de patients réanimés après un arrêt cardiaque (RAC). Chez ces derniers, la production de TNF par leurs monocytes est altérée en réponse au LPS, alors qu'il n'en est pas de même en réponse au Pam3CysSK4 et aux germes entiers. A l'inverse de ce qui fut observé chez les patients sepsis, la production ex vivo d'IL-10 par les monocytes n'est pas accrue. Si l'augmentation de l'expression des ARNm de SIGIRR est également observée, ce n'était pas le cas de MyD88s. Il apparaît donc que l'altération de la réponse des monocytes à différents agonistes bactériens chez les sujets SIRS diffère selon la présence ou non d'une infection. En définitive, les termes "anergie", "immunodepression", ou "paralysie immunitaire" sont très excessifs et sans doute l'expression "reprogrammation leucocytaire" définit au mieux ce phénomène. Ce travail est mené en collaboration avec le Dr. Christophe Adrie (Hôpital Delafontaine, Saint-Denis) et Rudi Beyaert (Ghent University, Belgium).

2- PRODUCTION DE MIF AU COURS DU SEPSIS (V. Maxime, C. Fitting)

Le macrophage migration inhibitory factor (MIF) est une cytokine inflammatoire qui s'oppose aux effets des glucocorticoïdes. En collaboration avec le Prof. D. Annane (Hôp. R. Poincaré, Garches), nous avons analysé chez les patients sepsis la production de MIF in vitro par les leucocytes sanguins de sujets normaux et de patients sepsis, en réponse à différents activateurs. Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) des patients sepsis contiennent des taux intracellulaires de MIF plus élevés que les cellules de sujets sains. Mises en culture, les PBMC de patients sepsis libèrent spontanément plus de MIF que les cellules de sujets sains ainsi qu'en réponse à certains stimuli. Par contre, les PBMC des patients sepsis traités par les glucocorticoïdes présentent une normalisation de leur libération de MIF. Ainsi, le MIF apparaît comme la première cytokine pro-inflammatoire décrite dont la libération ex vivo par les cellules circulantes est accrue au cours du sepsis. À l'inverse des modèles animaux, le traitement des patients en choc septique par les glucocorticoïdes normalise la libération de MIF par leurs leucocytes (Maxime et al. J. Infect. Dis. 2005, 191, 138).

3- CYTOKINES ET MUCOVISCIDOSE (A-F. Petit-Bertron, M. Adib-Conquy, C. Fitting)

Nous étudions les neutrophiles (PMN) isolés de liquide d'expectoration d'enfants souffrant de mucoviscidose (CF). Ceux-ci présentent une production spontanée ex vivo très élevée d'IL-8 comparativement aux PMN sanguins. Celle-ci ne peut pas être accrue par le LPS ni inhibée par la dexamethasone, contrairement à ce qui est observé avec les neutrophiles circulants (Corvol et al. Am. J. Physiol. 2003, 284, L997). De même, l'IL-10 qui inhibe la production d'IL-8 par les PMN sanguins de sujets sains et CF stimulés par des produits bactériens (LPS, peptidoglycane), est sans effet sur la production d'IL-8 par les PMN dérivés des liquides d'expectoration. Chez ces patients, l'expression de TLR2 est significativement réduite à la surface des PMN sanguins de sujets CF, tandis que l'expression de TLR4 est significativement accrue à la surface des PMN d'expectoration. L'expression de CD64, (récepteur Fcγ type I), marqueur d'activation, est fortement accrue à la surface des PMN circulants des enfants CF. Les neutrophiles issus des voies aériennes de patients CF, en interaction avec des cellules épithéliales respiratoires CF présentent une durée de vie significativement augmentée comparativement aux neutrophiles sanguins des mêmes patients et aux neutrophiles collectés chez des sujets sains (réduction de l'apoptose). Par ailleurs, l'interaction entre neutrophiles de patients CF et cellules épithéliales bronchiques CF induit une amplification de la production de cytokines pro-inflammatoires (IL-6 et IL-8), comparativement à des co-cultures de neutrophiles de sujets sains avec des cellules épithéliales bronchiques normales. (Ces travaux sont menés en collaboration avec les Drs H. Corvol, O. Tabary, J. Jacquot et A. Clément (Hôp. Trousseau) et sont financés par l'Association "Vaincre la Mucoviscidose").

4- SIGNALISATION VIA LES VOIES TOLL-LIKE RECEPTORS (TLR) et NOD1 DANS LES MACROPHAGES (R.Kapetanovic, C. Fitting,  M. Adib-Conquy)

En collaboration avec Dana Philpott (Immunité Innée & Signalisation, Inst. Pasteur), nous cherchons à caractériser l'implication des molécules TLR2, TLR4, et Nod1 & 2 dans l'activation des voies de signalisation qui mènent à des productions différentielles de TNF ou d'IL-10. Les TLR sont des molécules hautement conservées qui jouent un rôle de récepteurs des produits microbiens (PAMPs). D'autres molécules Nod1 et 2 sont des récepteurs intracytoplasmiques qui reconnaissent des muropeptides dérivés des peptidoglycanes. On peut donc suspecter que les macrophages qui sont des cellules phagocytaires puissent aussi bien être activés par leur récepteurs de surface (certains TLR) ou de façon intracellulaire par les molécules Nod. Nous recherchons donc la contribution respective de ces récepteurs dans la production de cytokines pro- et anti-inflammatoires initiée par des bactéries entières. A l'aide de souris génétiquement invalidées, nous avons montré que TLR4 et TLR2 jouaient in rôle essentiel lors de la réponse à des bactéries à Gram négatif mais pas à Gram positif. Cependant en absence de TLR2, la phagocytose est requise pour l'induction de TNF et d'IL-10 en réponse aux germes tués de Staphylococcus aureus (HKSA). A l'aide de cellules RAW 264.7 transfectées avec les formes dominants négatifs de Nod1 et de Nod2, nous avons montré que ces deux molécules inhibaient l'activation de NF-κB en réponse aux HKSA. L'interférence inattendue de Nod1 en réponse à des agonistes de Nod2 fut également confirmée par des expériences de surexpression de Nod1 dans des cellules HEK293T. Nous avons monté à l'aide d'expériences d'immunoprécipitation que les deux molécules Nod1 et Nod2 ont la capacité de former des hétérodimères. Enfin, le LPS et les HKSA augmentent l'expression des ARNm de Nod1 et 2, établissant un "cross-talk" entre d'une part les molécules Nod et d'autre part les molécules Nod et les TLR.

5- ETUDE DU PHÉNOMÈNE DE TOLÉRANCE AUXENDOTOXINES (C. Fitting, M. Adib-Conquy)

D'une part, nous avons étudié la capacité de l'interféron gamma (IFNγ) ou du granulocyte monocyte-colony stimulating factor (GM-CSF) à lever l'état de tolérance. Dans les cellules tolérantes au LPS, IRAK-1 est peu exprimé. L'IFNγ et le GM-CSF permettent de rétablir l'expression d'IRAK-1 dans les monocytes tolérisés par une faible dose de LPS, mais pas avec une forte dose. L'activation d'IRAK-1 et son association à MyD88 sont également favorisées par l'IFNγ et le GM-CSF. Ces cytokines permettent donc, dans le cas d'une tolérance induite par une faible concentration de LPS, de rétablir dans les monocytes l'activation d'IRAK-1, son association avec MyD88, l'activation de NF-κB en réponse au LPS, et en final la production de TNF (Adib-Conquy & Cavaillon, J. Biol. Chem. 2002, 277, 27927).

D'autre part, après une injection de LPS chez la souris, nous avons analysé ex vivo l'état de tolérance aux endotoxines de cellules issues de différents compartiments (rate, moelle osseuse, péritoine, poumon, sang périphérique) ainsi que le niveau de tolérance croisée avec des germes tués de S. aureus. L'analyse est effectuée en termes de production de TNF. Le phénomène de tolérance s'établit avec des cinétiques différentes et pour des durées différentes au niveau des splénocytes, des cellules des lavages péritonéaux, des cellules de la moelle osseuse et des cellules circulantes. Par contre, les cellules des lavages alvéolaires acquièrent un état de tolérance très modeste et de courte durée. La tolérance croisée avec les germes de Staphylocoque n'est pas parallèle à l'état de tolérance aux endotoxines. Ces travaux démontrent la compartimentalisation de la tolérance et le comportement particulier des cellules alvéolaires (Fitting et al. J. Infect. Dis. 2004, 189, 1295)

6- MODULATION PAR L'ADHÉRENCE DES PROPRIÉTÉS DE L'IL-10 (A-F. Petit-Bertron, M. Adib-Conquy)

L'adhérence des monocytes influence les propriétés immunomodulatrices de l'IL-10. Nous avons montré qu'en réponse à une stimulation ultérieure par le LPS, des monocytes prétraités avec de l'IL-10 dans des conditions qui préviennent l'adhérence des cellules, produisent davantage de TNF, alors que dans des conditions d'adhérence, l'IL-10 inhibe cette production. Cet effet paradoxal est retrouvé au niveau de l'ARNm du TNF et du facteur de transcription NFκB (Adib-Conquy et al. Int. Immunol. 1999, 11, 689). Les cinétiques d'activation de STAT-3, tyk2 et d'induction de suppressor of cytokine signaling (SOCS)3 et de l'hème oxygenase-1, en réponse à l'IL-10 sont influencées par l'existence de l'adhérence leucocytaire (Petit-Bertron et al. J. Leuk. Biol. 2003, 73, 145). L'influence de l'adhérence et de l'IL-10 a été étudiée par macroarray sur l'expression de 1050 gènes. Seize gènes sont régulés différemment par l'IL-10 selon que les monocytes sont adherents ou non. Certains résultats ont été confirmés par RT-PCR ou après analyse des protéines. Dans les cellules adhérentes, l'IL-10 inhibe fortement l'expression de la coproporphyrinogène oxidase (enzyme impliquée dans la biosynthèse de l'hème), ce qui pourrait être un des mécanismes par lesquels l'IL-10 contribue à l'anémie. En absence d'adhérence, l'IL-10 inhibe l'expression des gènes codant pour SOCS1, 2 et 3, ce qui pourrait contribuer à ses effets pro-inflammatoires observés dans ces conditions de culture. Enfin, en absence d'adhérence, l'IL-10 induit l'expression de plusieurs métalloprotéinases, molécules trouvées dans la circulation sanguine lors d'états inflammatoires. Ces observations confirment les effets ambivalents de l'IL-10, et notre modèle pourrait mimer des évènements consécutifs à l'activation dans la circulation sanguine, de monocytes appelés à adhérer à l'endothélium et à migrer au sein des tissus inflammatoires. Ce travail a été effectué en collaboration avec T. Pedron et la plate forme 2, puces à ADN de l'IP (Petit-Bertron et al. Cytokine 2005, 29, 1).

7- SÉROTONINE ET PRODUCTION DE CYTOKINES (I. Cloëz-Tayarani)

La sérotonine (5-hydroxytryptamine = 5-HT) est libérée par les plaquettes activées et peut se trouver à des concentrations micromolaires aux sites d'inflammation. Nous avons étudié l'effet de la 5-HT sur la production de cytokines par les PBMC humaines activées par le LPS, et sur la régulation de l'expression de leurs gènes. La 5-HT régule de façon différentielle la production de cytokines : elle inhibe significativement et de façon dose-dépendante la production de TNF tandis qu'elle augmente à plus fortes doses celle d'IL-1β. L'effet inhibiteur de la 5HT est réversé par un antagoniste sélectif du récepteur 5HT2A (kétansérine) et mimé par un agoniste sélectif des récepteurs 5HT2A/2C (DOI). Ces résultats qui suggèrent l'implication du récepteur 5HT2A dans les effets de la sérotonine, sont confirmés par l'identification par Western-blot de ce récepteur au niveau des PBMC. Ces résultats suggèrent l'implication de la sérotonine dans la modulation des processus inflammatoires et la production de cytokines (Cloëz-Tayarani et al. Int. Immunol. 2003, 15, 233). Une étude plus récente démontre l'activation de l'extracellular signal-regulated kinase (ERK) au sein des lymphocytes mis en culture en présence de sérotonine. Le phénomène semble être lié à l'activation via un récepteur 5-HT1A puisque des résultats similaires sont obtenus en présence de R-(+)-8-hydroxy-DPAT, un agoniste sélectif du récepteur 5-HT1A . De plus, la phosphorylation de ERK induite par la sérotonine est inhibée en présence de WAY100635, un antagoniste sélectif du récepteur 5-HT1A (Cloëz-Tayarani et al. Life Sci. 2004, 76, 429).

Figure 1. De la bactérie à la maladie. Au cours des infections, les cellules de l'hôte sont activées par les produits bactériens (LPS: lipopolysaccharide; PGN: peptidoglycane; ADN…) via des récepteurs spécifiques (TLR: Toll-like receptors; PGRP: peptidoglycan recognition proteins; Nod: nucleotide-binding oligomerization domain). Cette activation aboutit à la production de nombreux médiateurs de l'immunité innée et de l'inflammation (TNF: tumor necrosis factor; IL-1: interleukin-1; NO: monoxyde d'azote…). D'autres évènements, également actives par les produits bactériens (activation du complément, activation de la coagulation), amplifient le processus inflammatoire. La production exacerbée des médiateurs inflammatoires contribue à la défaillance organique et éventuellement au décès. De façon concomitante, l'inflammation est régulée par la production de médiateurs anti-inflammatoires (IL-10; IL-1Ra: interleukin-1 receptor antagonist; sTNFR: soluble TNF receptors…), des protéines de la phase aiguë de l'inflammation (LBP: LPS binding protein; sCD14: soluble CD14…), des neuromédiateurs et des hormones. Ces médiateurs ainsi que l'existence de phénomène d'apoptose des leucocytes contribuent à altérer le statut immunologique (Annane, Bellisant, Cavaillon, The Lancet, 2005, 365, 63)

Figure 2. Schéma des voies de signalisation induites par les LPS. Après son interaction avec son récepteur (le complexe CD14/MD2/TLR4) le LPS initie deux voie principales de signalisation dépendante ou indépendante de MyD88. Au cours du sepsis, la reprogrammation leucocytaire est associée à l'altération de la voie NF-κB (sur fond gris), à l'amplification d'autres voies (Sp1) et à l'augmentation de molécules impliquées dans la régulation négative des voies TLR4 (SIGIRR, MyD88s) (sur fond jaune). Ce schéma tient compte de nos travaux (Adib-Conquy et al. Am. J. Respir. Crit Care Med. 2000, 162, 1877, Adib-Conquy et al J. Leuk. Biol. 2001; 70:30; Adib-Conquy et al. Am. J. Respir. Crit Care Med. 2003, 168, 158) ainsi que des travaux rapportés dans la littérature (Learn et al. J. Biol. Chem. 2001; 276:20234 ; Solomon et al. J. Clin. Invest. 1998; 102:2019). (adapté de Annane, Bellisant, Cavaillon, The Lancet, 2005, 365, 63).

Mots-clés: Toll-like receptor, sepsis, signalisation intracellulaire, endotoxine, immunité innée


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