Unité: Cellules souches et développement

Responsable: Tajbakhsh Shahragim

Nos recherches sont principalement centrées sur la façon dont les cellules souches sont maintenues et la restriction de leur destin au cours du développement. Notre modèle est le muscle squelettique aux stades embryonnaire, foetal, et post-natal. Nous utilisons une approche génétique chez la souris par knock-in et transgénèse afin d'identifier les réseaux génétiques qui régissent la destinée des cellules, leur auto-renouvellement et les caractéristiques de niches. Nous étudions également la façon dont les cellules souches du muscle donnent naissance à des populations de cellules différentes, ainsi que le rôle des divisions symétriques et asymétriques des cellules dans l'établissement et le maintien du lignage.

Régulation génétique et cellulaire de l'identité du muscle squelettique

Le développement du muscle squelettique est un excellent modèle pour l'étude de l'acquisition de la destinée cellulaire, de la transition de cellule souche en cellule différenciée ainsi que de l'auto-renouvellement de cellules souches et de l'homéostasie tissulaire. Des facteurs de transcription clé possédant un motif "paired-box/homeodomain", Pax3 et Pax7, et les facteurs de régulation myogénique à motif bHLH (MRF) Myf5, Myod, Mrf4 et Myogénine ont été identifiés. Durant les dix dernières années, la régulation génétique de ce tissu s'est révélée complexe, correspondant notamment à une logique basée en partie sur des critères embryologiques. Par exemple, les différences spécifiques comme celles propres à la tête ou au corps se traduisent par des directions épistatiques différentes. En utilisant des souris double-mutantes, nous avons démontré précédemment que le Pax3 et Myf5 agissaient en amont de Myod dans l'embryon (Tajbakhsh et al. 1997). Ces résultats ont établi une hiérarchie génétique dans les muscles dérivés du somite dans l'embryon. Parallèlement, la présence de muscles dans la tête mais pas dans le corps ont révélé que les territoires embryologiques activent des cascades génétiques distinctes selon la région anatomique concernée.

Nous étudions d'autres gènes impliqués dans le développement précoce du muscle squelettique : le récepteur à tyrosine kinase, Met et Pax7. Pax7 joue un rôle clé dans les cellules satellites postnatales. Nous recherchons le rôle de ce gène, en combinaison avec Myf5, dans l'embryon et dans les cellules satellites adultes, en créant de nouveaux allèles à ces loci. Nous avons également examiné le rôle de Mrf4, qui a été classé comme gène de différenciation, et avons montré que ce facteur de régulation pouvait établir l'identité du muscle squelettique dans l'embryon. Ainsi, l'inactivation de Myf5, Myf4 et Myod est requise pour éliminer tous les muscles squelettiques (Kassar-Duchossoy et al. 2004). Ces mutants, en combinaison avec les souris nulles pour Pax3, nous fournissent des modèles où nous découplons la myogenèse de la tête de celle du corps tout comme la myogenèse embryonnaire de la myogenèse fœtale. Cette régulation génétique complexe peut être expliquée en partie par une hétérogénéité des cellules dans ce lignage. Cependant le lignage du muscle squelettique reste indéterminé et flou malgré le fait que des réseaux de gènes soient déjà mis en évidence. Nous avons proposé qu'un ordre hiérarchique définisse les populations de cellules dans le muscle squelettique (Tajbakhsh, 2003, 2005) sur la base de données génétiques, et nous avons confirmé ceci récemment (Kassar-Duchossoy et. al. 2005)..

Nous avions précédemment montré qu'en l'absence de Myf5, les progéniteurs du muscle restaient multipotents et pouvaient changer de destin dans l'embryon en fonction de leur environnement. Nous avons ainsi créé par knock-in différents allèles dans le locus de Myf5 pour étudier ces cas de façon détaillée. Nous disposons ainsi de knock-in de nlacZ, Myod et GFP. Outre la mise en évidence des régulations génétiques qui gouvernent la myogénèse squelettique, ces souris vont permettre la caractérisation moléculaire et cellulaire des cellules souches/progénitrices du muscle squelettique. Par exemple, les souris knock-in Myf5GFP nous ont permis d'isoler par FACS des cellules satellites post-natales destinées à l'étude de greffes chez des souris immuno-déprimées. Ces greffes, de 500 à 5000 cellules satellites, se sont révélées particulièrement efficaces (en collaboration avec A. Cumano, J. Di Santo, V. Mouly).

Dans une perspective développementale et embryologique, nous nous intéressons également à la ségrégation des lignages cellulaires dans le somite. Nous étudions particulièrement les perturbations constatées au niveau des côtes distales chez des souris nulles pour le gène Myf5. Il s'agit de mettre en évidence si les progéniteurs des côtes distales proviennent du sclérotome ou du dermomyotome. Étant donné que Myf5 n'est pas exprimé dans le sclérotome, nous avons cherché les causes des désordres affectant les côtes distales chez ces mutants. Nous avons examiné un certain nombre d'allèles sur le locus de Myf5 et il apparaît que la régulation de ce locus joue un rôle important dans le résultat de la ségrégation des cellules progénitrices dans le somite.

Identification et caractérisation des cellules souches du muscle squelettique

Nous étudions la fonction des cellules souches du muscle en utilisant différentes stratégies. Pendant la régénération du muscle chez l'adulte, les cellules satellites sortent de leur état quiescent, s'activent et se divisent pour générer des précurseurs, ou myoblastes, qui pourront fusionner avec les fibres en régénération. Il est important de noter que de nouvelles cellules satellites seront générées une fois l'homéostasie rétablie. Une approche ex vivo consiste à analyser des explants ou des cultures primaires de cellules satellites. L'étude se focalise sur la transition de l'état souche à l'état différencié de ces cellules, avec une attention particulière sur leur mode de division, asymétrique vs symétrique. Nous utilisons des techniques d'imagerie en temps réel pour étudier les événements d'auto-renouvellement et de différenciation dans l'organisme vivant et en culture. Nos études utilisant le facteur Numb, déterminant du destin cellulaire, révèlent que l'asymétrie fonctionne dans les myoblastes dérivés des cellules satellites et nous avons des images dans le temps de divisions asymétriques des cellules de ce lignage. Nous envisageons d'étendre ces recherches à l'organisme et d'utiliser une approche de transgenèse pour manipuler le destin des cellules souches, dans le but de modifier les décisions d'identité cellulaire et d'identifier les facteurs impliqués dans cette décision importante.

Pour identifier de manière non biaisée les régulateurs de Myf5 et ceux qui interviennent dans l'émergence des progéniteurs musculaires, nous avons utilisé des puces Affymetrix. Des souris knock-in Myf5GFP hétérozygotes et homozygotes ont été utilisées pour isoler les progéniteurs musculaires de l'embryon et les cellules satellites de l'adulte. L'analyse des données est en cours.

Légendes des photos :

Où sont localisées les cellules souches du muscle et comment se renouvellent-t-elles ?

Figure 1. Durant le développement embryonnaire, les cellules souches du muscle squelettique dans le corps sont localisées dans les somites, unités segmentées transitoires, localisées de part et d'autre du tube neural sur l'axe antéro-postérieur (A). Plus tard, elles se répartissent dans l'épithélium du dermomyotome et pendant l'étape fœtale (B), on les retrouve dans les masses de muscle squelettique. Au stage post-natal et adulte, les cellules satellites représentent une population potentielle de cellules souches. Les cellules satellites peuvent être identifiées génétiquement et se distinguent des cellules myonucléées, comme on peut le voir sur les fibres isolées de souris knock-in Myf5nlacz/+ (C). Les myoblastes dérivés des cellules satellites peuvent subir des divisions asymétriques comme le montre la ségrégation du facteur Numb (rouge ; anaphase, DNA bleu) dans une seule des cellules filles durant la mitose.

Figure 2. Identification d'une nouvelle population de cellules myogéniques Pax3+/Pax7+. Les mutants Myf5GFP-P/GFP-P:Myod-/- ont permis de bloquer l'engagement des cellules dans le lignage musculaire. En l'absence de muscles squelettiques foetaux, une population de cellules primitives est identifiée par l'expression de Pax7 (A). Ces cellules (rouge) sont intimement associées aux fibres embryonnaires exprimant la Desmine (vert). Les noyaux sont marqués par le Hoechst (bleu). Ces cellules primitives sont détectées dans tous les muscles du tronc et des membres durant le développement prénatal. A certains stades du développement, elle peuvent êtres distinguées de leur descendants, les cellules progénitrices qui vont ensuite générer des précurseurs, les myoblastes. Ces expériences ont abouti à une définition des différents états cellulaires : cellule souche, progénitrice, précurseur et différenciée (B). Aux stades foetaux tardifs, les désignations "souche" et "progénitrice" se chevauchent car la plupart des cellules non différenciées co-expriment Pax7 et Myf5.

Mots-clés: cellules souches, division cellulaire asymétrique, muscle squelettique, somites, cellules satellites, Myf5, Myod, Mrf4, Pax3, Pax7, Numb


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