Unité: Carcinogenèse hépatique et virologie moléculaire

Responsable: Patrizia Paterlini-Bréchot

Les infections par le VHB et le VHC (environ 350 millions de personnes dans le monde sont infectées par le VHB et 300 millions par le VHC) sont caractérisées par le risque fort de passage à la chronicité (5% chez l'adulte pour le VHB, 60-80% en néonatal ; 70-80% pour le VHC) ce qui implique le risque de développer une cirrhose et un cancer du foie (HCC). Les traitements antiviraux ont indiscutablement progressé avec l'utilisation de l'interféron et de la Lamivudine pour le VHB et l'association de l'interféron à la ribavirine pour le VHC. L'efficacité de ces traitements reste cependant insuffisante, permettant un taux de réponse prolongée de 30 à 40% en moyenne pour le VHC.

La carcinogenèse hépatique est liée à la combinaison dans le foie d'un patient porteur chronique du VHB ou du VHC, de l' inflammation chronique, des effets directs de protéines virales et (pour le VHB) de l'intégration du génome viral : 1) l'inflammation joue un rôle essentiel dans formation de la fibrose et la dérégulation de la prolifération hépatocytaire. Ce point est illustré par le développement des HCC dans environ 90% des cas sur un foie cirrhotique ou avec hépatite chronique active, le risque d'HCC chez un patient cirrhotique étant d'environ 30-50 % après dix ans de suivi. 2) certaines protéines du VHB et du VHC, ainsi que l'insertion de l'ADN du VHB dans l'ADN chromosomique, exercent des effets directs sur la prolifération et la viabilité hépatocytaire, sur la réponse à l'interféron et sur la production des cytokines (TNFalpha). 3) des altérations génétiques récurrentes (délétions et amplifications de certains loci chromosomiques), ont été récemment identifiées grâce au développement des analyses génétiques appliquées aux HCC. (Revues générales:Ozturk Seminars in liver diseases, 1999,19:235. Bréchot : Seminars in Cancer Biology, 2000;10:211-231; Buendia: Viral Hepatitis; Zuckerman et Thomas Ed, Churchill Livingstone 1998, 179-200 ; Thorgeirsson SS, Grisham JW, Nature Genetics, 31, 339,2002).

Dans ce contexte, le programme de notre groupe est centré sur les points suivants :

Prolifération et adhésion hépatocytaire :

1) Equipe C. Desdouets - Ce groupe a initié une étude sur les mécanismes qui régulent la ploîdie hépatocytaire, à la fois au cours du développement hépatique et dans des conditions pathologiques comme au cours des infections virales et aux différents stades de la carcinogenèse hépatique. Les approches techniques permettant la quantification du contenu en ADN des noyaux hépatocytaires, l'étude des protéines ayant un rôle dans la cytodiérèse, et l'implication des inhibiteurs des kinases (P27 et P21) sont en train d'être mises au point ou sont en cours d'application. Au cours de l'année 2003 cette équipe a caractérisé la cinétique in vivo de la polyploïdisation hépatique et démontré que le blocage de la cytokinèse détermine la formation d'hépatocytes binuclées, une étape fondamentale dans le processus de polyploidisation.

2) Equipe L. Christa  - Protéine HIP, adhésion hépatocytaire et marquage de cellules "progénitrices" :Cette équipe a montré l' interaction de cette lectine de type C avec la sous-unité RIIa de la PKA. Le projet en cours vise la définition de la fonction de la protéine HIPPAP in vivo, dans des cellules souches embryonnaires et hépatiques, au cours de la régénération hépatique chez la souris transgénique, et in vitro, par la recherche d'intéractions protéine-protéine (méthode protein chip Ciphergen)

3) Equipe J. Faivre - L'étude de la caractérisation des transcrits du gène cycline A2 a pu mettre en évidence des nouveaux variants d'épissage de ce gène. La localisation subcellulaire et l'étude de la fonction des protéines correspondantes sont en cours de réalisation.

Persistance des virus des hépatites B (VHB) et C (VHC) :

1) Equipe D. Kremsdorf - a) Les études de ce groupe sur la protéine MxA ont permis de confirmer son effet antiviral sur le VHB in vivo. Des souris transgéniques pour le VHB ou pour le gène MxA ont été croisées et le niveau d'expression du VHB a été étudié dans la descendance. Chez les femelles doubles transgéniques, cette équipe a observé une diminution de la réplication du VHB. Ces résultats démontrent la participation de la protéine MxA à l'activité antivirale de l'interféron contre le VHB ; b) les travaux de l'équipe ont démontré qu'in vivo l'expression de la protéine HBSP, codée par l'un des ARNs épissés du VHB. Cet ARN épissé est également encapsidé et rétrotranscrit et donne lieu à la sécrétion de particules défectives. L'expression de la protéine HBSP a été corrélée à la réplication virale ainsi qu'à la sévérité de la fibrose hépatique. De plus, un rapport particules défectives/sauvages significativement plus élevé chez des patients avec fibrose sévère comparé à des patients avec firose modérée ou nulle a été observé. Ces résultats suggèrent que la protéine HBSP et les particules défectives jouent un rôle dans la pathogenèse de l'infection par le VHB et en particulier dans la fibrose hépatique. c) Cette équipe a établi le modèle murin de repopulation d'hépatocytes humains dans le foie de souris immunodéficientes et transgéniques pour l'activateur du plasminogéne. La persistance de la greffe a été améliorée de façon significative en diminuant la réponse immunitaire innée. Le niveau de la différenciation hépatocytaire a été confirmé par la susceptibilité des hépatocytes humains à l'infection par le Plasmodium Falciparum et le VHB. Ceci constitue une avancée majeure pour l'étude in vivo de l'infection de virus hépatotropes. De plus, ce modèle murin a permis de démontrer que des lignées hépatiques embryonnaires de souris ont la capacité de se différencier, dans en contexte in vivo, en hépatocytes ou en cellules biliaires.

Carcinogenèse hépatique et infections virales (VHB, VHC) :

1) Equipe N. Pavio, C. Bréchot - Cette équipe étudie l'effet biologique de séquences de capside du VHC isolées à partir du tissu tumoral et non tumoral de patients avec cancer du foie. Récemment, elle a mis en évidence que les variants de capside isolés à partir de tissus tumoraux inhibent de manière ciblée la voie du TGF-β impliquée dans la fribrose et le contrôle de la prolifération cellulaire. L'étude du mécanisme moléculaire a mis en évidence une interaction directe entre les capsides tumeur avec Smad3, un des facteurs de transcription activé par le TGF-β et un blocage de l'interaction du complexe Smad3/4 avec l'ADN. Ce processus pourrait contribuer au développement du CHC.

2) Equipe V. Thiers - F. Demaugre - Nous développons un projet ayant pour objectif d'étudier à partir de cellules hépatocytaires isolées par microdissection laser chez des sujets ayant développé un CHC sur cirrhose virale C : 1) la variabilité intra-hépatique de la capside du VHC afin d'identifier de nouveaux variants naturels de la protéine de Capside du VHC 2) l'étude comparative des protéomes d'hépatocytes tumoraux et non-tumoraux. L'approche repose sur l'association de l'électrophorèse bi-dimensionnelle (2D-PAGE) et de la spectrométrie de masse pour identifier les protéines différentiellement exprimées dans le CHC lié au VHC. L'objectif à terme de cette étude est d'utiliser les données obtenues dans cette investigation, pour définir de nouveaux outils diagnostiques et/ou thérapeutiques pour le traitement du cancer du foie. Parallèlement, le Centre de Référence pour les hépatites B et C contribue à la surveillance moléculaire et à l'identification des risques résiduels de transmission de ces virus.

3) Equipe P. Paterlini-Bréchot - Les travaux de cette équipe, axés sur la mutagenèse insertionnelle en carcinogenèse hépatique, ont montré que le génome du VHB est intégré dans un gène cellulaire important pour la croissance cellulaire dans plus de 50% des cas. De plus le gène télomerase est la cible récurrente de l'intégration virale. Ce résultat montre pour la première fois l'impact de la mutagenèse insertionnelle dans un cancer humain et révèle un aspect etiopathogénétique nouveau en carcinogenèse hépatique.

4) Equipe P. Paterlini-Bréchot - Un nouveau axe de recherche a débuté par la mise en évidence de l'impact de la signalisation calcique dans le mécanisme d'action de la protéine core du VHC (qui est transformante et tumorigène) et de la protéine X du VHB (proapoptotique, impliquée en carcinogenèse). Ces résultats ouvrent la voie à un projet qui vise l'étude du rôle de la signalisation calcique en carcinogenèse hépatique.

Nouvelles approches pour le traitement des HCC :

1) Equipe J. Faivre : Thérapie génique : nous avons analysé chez des rats traités par des carcinogènes chimiques (DEN) et la marmotte infectée par le WHV l'efficacité réelle de transduction par des vecteurs adénoviraux des cellules tumorales, l'importance de la voie d'injection artérielle en association avec des injections intra-tumorales. Nous avons montré la nécessité du « ciblage » transcriptionnel des gènes suicides aux cellules tumorales. Nous avons démarré un projet sur l'utilisation du gène NIS (Natrium Sodium Symporter) qui permet de pomper l'iode radioactif dans les cellules tumorales pour les détruire. Nos premiers résultats obtenus sur le modèle de rat DEN indiquent qu'après infection du foie par un adénovirus recombinant CMV-NIS administré, la captation iodée est très importante et durable (demi-vie biologique de plusieurs jours). Une inhibition de la croissance tumorale des gros nodules, ainsi qu'une régression complète de petit nodules et une augmentation de la survie ont été observées après injection de 18mCi d'iode 131. Un objectif à moyen terme est d'optimiser le ciblage de l'expression de la pompe dans le foie tumoral.

2) Equipe P. Paterlini-Bréchot - Cellules métastatiques: nous avons montré l'intérêt de la détection des cellules circulantes métastatiques par la méthode ISET. Notre étude a démontré pour la première fois, par une analyse très spécifique des cellules tumorales circulantes, que leur présence et nombre sont directement corrélés à la survie de patients avec cancer du foie. La microdissection et analyse moléculaire de ces cellules a montré que les mutations du gène beta-caténine ne sont pas essentielles pour la diffusion spontanée des cellules tumorales dans le sang.

La même méthode ISET a trouvé une application surprenante dans l'isolement et caractérisation moléculaire et génétique des cellule fœtales circulantes. Nous avons montré la possibilité d'effectuer un diagnostic prénatal non invasif chez des mères à risque d'avoir un enfant avec amiotrophie spinale. Cette nouvelle approche ouvre la voie au diagnostic prénatal non invasif des maladies génétiques.

Recherche clinique et thérapeutique :

Nous avons organisé la constitution de banques d'ADN de patients infectés par le VHC et des patients ayant une cirrhose alcoolique pour la recherche de polymorphismes génétiques associés aux différentes formes de maladie hépatique. Plusieurs études pharmacologiques et une étude de vaccinothérapie (VHB) sont en cours pour l'amélioration du traitement des hépatites virales B et C. Nous sommes en train d'analyser l'impacte de l'infection par le VHC sur le métabolisme lipidique et son rapport avec la virémie, les traitements anti-viraux et par fibrates. Nous avons analysé les profils évolutifs des maladies biliaires cholestasiantes du foie et réalisé l'évaluation des traitements actuellement proposés. Un projet centré sur l'intervention de facteurs génétiques impliqués dans le déclenchement et/ou la sévérité de la CBP est en cours de développement.

1) Equipe ML Michel - Prévention et traitement des infections virales chroniques par vaccination spécifique.

Le travail de cette équipe est orienté vers la prévention et l'immunothérapie des infections chroniques dues aux virus de l'hépatite B (VHB) et de l'immunodéficience humaine (VIH). Un essai clinique de phase I de vaccinothérapie spécifique basé sur l'injection d'ADN nu codant pour les protéines d'enveloppe du VHB a été réalisé en collaboration avec le service d'hépatologie de l'hôpital Necker (Pr. Brechot, Pr. Pol and Dr. H. Fontaine). L'équipe a montré que des réponses T spécifiques du VHB peuvent être induites ou réactivées chez des patients porteurs chroniques du virus. Un essai de phase II est prévu pour confirmer ces résultats et étudier l'efficacité clinique de cette approche. Un protocole de recherche clinique est également en cours pour identifier chez les patients infectés ou guéris la présence de lymphocytes T spécifiques de la protéine HBx du VHB.

Dans le modèle animal du singe infecté par le virus de l'immunodéficience simienne (SHIV), cette équipe a étudié, après épreuve infectieuse par le virus SHIV, le devenir des cellules T CD4+ et CD8+ activées par vaccination spécifique. Elle a montré que contrairement aux cellules T CD8+ qui sont rappelées par l'infection, les cellules T CD4+ spécifiques de SHIV sont éliminées de manière préférentielle. Ces résultats pourraient avoir d'importantes implications dans le domaine de la vaccination préventive ou thérapeutique contre le virus du SIDA (collaboration avec Y. Rivière, I.P. et R. LeGrand, CEA).

2) Equipe A. Budkowska a quitté l'unité en septembre 2004. Cette équipe a montré que la protéine de la capside et les nucléocapsides non-enveloppées ont la capacité d'interagir avec les IgG humains " non-immuns " via leur domaine Fcg. Le site " FcgR-like " formé par la protéine de la capside est conformationnel, et exige la présence de la séquence aa (3-75) pour son activité optimale . Les études par Surface Plasmon Resonance (SPR) ont démontré que l'activité "FcgR-like" de la protéine de la capside comme FcRn interagit avec les IgG en pH acide (6-6.5). Les études par SPR ont également suggéré que la protéine de la capside est capable de fixer un anticorps anti-capside par "bipolar bridging ": par son paratope sur l'épitope correspondent et par le domaine Fcg d' IgG sur le motif "FcgR-like " 

La fonction " FcgR-like " de la protéine de la capside, exprimée sur les cellules infectées et/ou sur les nucléocapsides du VHC dans le sérum pourrait offrir à ce virus la possibilité d'échapper aux mécanismes de défense immunitaires médiés le domaine Fcgdes anticorps anti-capside et/ou interférer avec la fonction du FcRn.

Mots-clés: Carcinogenèse hépatique, VHB-VHC, ploïdie hépatocytaire, mutagenèse insertionnelle, cellules tumorales circulantes, thérapie génique, vaccinothérapie


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