Unité: Biochimie Structurale

Responsable: ALZARI, Pedro M.

Nos travaux de recherche sont orientés vers l'étude de la structure tridimensionnelle de protéines et la spécificité des interactions protéine-ligands par les moyens de la cristallographie des rayons-X, la biochimie des protéines, la microcalorimétrie et la modélisation moléculaire. Nos thèmes de recherche sont focalisés sur l'étude structure-fonction d'enzymes impliquées dans les mécanismes de signalisation cellulaire chez les bactéries, de glycosidases et glycosyltransferases d'importance biomédicale, et de protéines mycobactériennes de fonction inconnue représentant des nouvelles cibles potentielles pour la chimiothérapie. Les principaux sujets de recherche sont décrits ci-dessous; plus d'information sur les différents projets de recherche en cours dans le laboratoire est disponible dans notre page Web : http://www.pasteur.fr/recherche/unites/Bstruct .

Trans-sialidases de trypanosomes (P.M. Alzari)

Les protozoaires flagellés Trypanosoma cruzi, l'agent causal de la maladie de Chagas dans le continent américain, et T. brucei , l'agent de la maladie du sommeil en Afrique, expriment une trans-sialidase de surface capable de catalyser le transfert d'acide sialique entre différentes glycoprotéines. L'expression de cette enzyme chez T. cruzi est directement liée au pouvoir d'infection du parasite. En collaboration avec les équipes de A.C. Frasch (Argentine) et de S. Withers (Canada), nous avons entrepris l'analyse structurale d'enzymes homologues de trypanosomatides pathogènes (T. cruzi, T. brucei) et non-pathogènes (T. rangeli ) afin de comprendre les bases moléculaires de l'activité de transglycosylation (synthèse de polysaccharides) et de permettre la conception rationnelle d'inhibiteurs pouvant servir à des fins thérapeutiques.

Nous avons préalablement déterminé les structures 3D de la sialidase de T. rangeli (Buschiazzo et al, EMBO J., 2000) et de la trans-sialidase de T. cruzi (Buschiazzo et al, Mol. Cell, 2002), et réalisé des études de mutagenèse dirigée des enzymes de T. cruzi (Paris et al, Glycobiol., 2001) et de T. brucei (Montagna et al, Eur. J. Biochem., 2002). Ces études ont montré que les trans-sialidases, à différence des sialidases, présentent un site actif intrinsèquement flexible. La fixation du substrat sialylé déclenche des changements structuraux qui servent à moduler l'affinité pour le substrat accepteur (les mucines chez T. cruzi), créant ainsi les conditions pour une activité de transglycosylation efficace. La comparaison structurale de la trans-sialidase de T. cruzi avec la sialidase de T. rangeli révèle un site catalytique très conservé, au sein duquel des subtiles modifications chimiques et structurales suscitent des changements remarquables dans l'activité catalytique et les propriétés d'inhibition des deux enzymes. Par ailleurs, la comparaison des structures 3D de différents complexes sialidase-inhibiteur - incluant des enzymes d'origine virale, bactérienne et de trypanosomes - révèle des caractéristiques distinctes, qui pourraient être exploitées pour la conception de nouveaux inhibiteurs spécifiques (Amaya et al, J. Mol. Biol., 2003). Par ailleurs, en utilisant un substrat activé nous avons pu pieger l'état intermédiaire et démontrer que la trans-sialidase (et probablement toutes les sialidases microbiennes) agissent par un mécanisme ping-pong, impliquant la formation d'un complexe covalent sialyl-enzyme avec un résidu tyrosine strictement conservé (Watts et al, J. Am. Chem. Soc, 2003 ; Amaya et al, Structure, 2004). Les ‘snapshots' des différentes étapes du cycle réactionnel demontrent que le mécanisme catalytique des sialidases et trans-sialidases est semblable à celui d'autres glycosidases qui agissent avec retention de la configuration, mais présentent quelques différences singulières ayant pu évoluer en réponse à la structure chimique particulier des acides sialiques.

Protéines kinases et phosphatases mycobactériennes (P.M. Alzari)

La phosphorylation réversible des protéines est la principale modification post-translationelle impliqué dans la signalisation cellulaire des organismes vivants. Chez les bactéries, la plupart des voies de signalisation font intervenir les systèmes à deux composantes impliquant une His-kinase et un receveur, tandis que chez les eucaryotes l'information est acheminée grâce à des Sér-, Thr- ou Tyr-kinases et phosphatases agissant en cascades ou en réseaux. Ces dernières années, cependant, plusieurs gènes codant pour des Sér/Thr/Tyr protéines kinases ou phosphatases ont été identifiés chez différentes procaryotes et le séquençage systématique de génomes bactériens a confirmé ces observations. Ainsi, le génome de Mycobacterium tuberculosis montre la présence de plusieurs Sér/Thr protéines kinases et phosphoprotéines phosphatases probablement impliquées dans la signalisation intracellulaire. En collaboration avec l'équipe de S.T. Cole (IP), nous avons entrepris l'étude de cette famille de protéines mycobactériennes afin de comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents et de contribuer au développement des nouveaux outils thérapeutiques.

Nous avons focalisé nos travaux sur deux enzymes de M. tuberculosis en particulier, la Ser/Thr protéine kinase PknB et la Ser/Thr phosphatase PstP. Les gènes correspondantes, pknB et pstP, se trouvent dans un opéron très conservé chez les actinobactéries, qui serait impliqué dans la régulation de la synthèse du peptidoglycane au cours de la croissance cellulaire. Les domaines catalytiques de PknB et PstP ont été exprimés chez E. coli et les protéines recombinantes purifiées à homogénéité pour des études biochimiques. Les structures 3D ont été déterminées par diffraction des rayons X, démontrant que le repliement des protéines et l'architecture du site actif sont très semblables à ceux des homologues eucaryotes (Ortiz et al, J. Biol. Chem., 2003, Wehenkel et al, en préparation). Par ailleurs, nous avons montré que PknB est un substrat de PstP, et que la déphosphorylation affecte son activité enzymatique. Deux thréonines dans la boucle d'activation de PknB (Thr171 et Thr173) ont été identifiés comme les sites de phosphorylation, la substitution de ces résidus par mutagenèse réduisant de manière significative l'activité catalytique. Ces résultats ont mis en évidence un mécanisme de régulation de l'activité kinase chez M. tuberculosis semblable à celui observé chez les homologues eucaryotes, et suggèrent que PknB et PstP pourraient jouer un rôle dans le contrôle de la croissance cellulaire (Boitel et al, Mol. Microbiol., 2003). Les études de phosphorylation ont été réalisées aussi pour d'autres kinases mycobactériennes (Duran et al, soumis pour publication). Des travaux pour identifier les substrats physiologiques de ces enzymes et pour caractériser les interactions enzyme-substrat sont en cours.

La génomique structurale des mycobactéries (P.M. Alzari)

L'arrivée des données issues du séquençage massif des génomes a imposé une nouvelle dynamique à la biologie structurale, entraînant un changement d'échelle dans le domaine et une nécessité d'accélérer les processus d'études au niveau mondial. Cela est maintenant possible grâce aux développements technologiques remarquables réalisés pour le clonage, l'expression, la purification et la caractérisation des macromolécules biologiques, ainsi que par les progrès réalisés dans les méthodes de détermination de structures, la cristallogenèse, la cryocristallographie et le développement de nouvelles sources de radiation synchrotron, pour ne citer que ces exemples. Nous souhaitons utiliser ces technologies pour contribuer au développement d'une meilleure chimiothérapie de la tuberculose. En particulier, nous nous proposons d'utiliser la génomique structurale comme un outil innovateur pour la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques.

Grâce au soutien du Réseau National des Génopoles, de l'Union Européenne et de l'Institut Pasteur, nous avons entrepris un projet de génomique structurale de mycobactéries. Le choix initial de cibles s'appuie sur l'analyse comparative des génomes de M. tuberculosis et M. leprae. Ces cibles incluent, d'une part, des protéines impliquées dans la croissance bactérienne et/ou la virulence des mycobactéries, mais aussi un nombre important de protéines de fonction inconnue dont l'analyse génomique suggère leur possible importance comme cibles thérapeutiques potentielles. Les subventions accordées pour la réalisation du projet nous ont permis de mettre en place deux plates-formes technologiques, l'une pour la production de protéines recombinantes (http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF5) et l'autre pour le clonage et la cristallogenèse à haut débit (http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF6). A présent, plus de 300 gènes mycobactériens ont été clonés dans des vecteurs d'expression bactériens, plusieurs protéines purifiées ont été soumises à des essais de cristallisation et plus d'une dizaine de structures tridimensionnelles ont été déterminées à haute résolution. L'état actuel du projet est décrit dans la page Web " Structural Genomics of Mycobacteria " (http://www.pasteur.fr/SGM)

Biologie moleculaire structurale: cristallographie et modelisation (Marc DELARUE)

A. Cristallographie de protéines.

La structure de la 6-phosphogluconolactonase (6PGL) de T. brucei, une cible potentielle de choix pour le drug design, a été résolue à 2.1 Angstrom de résolution grâce à un dérivé lourd au mercure, en collaboration avec V. Stoven (IP) et la Plateforme de Cristallogenèse (PF6, IP). La construction de la chaîne a été grandement facilitée grâce à un jeu de données collecté a l'ESRF sur des cristaux de protéine contenant des SeMet. L'affinement est maintenant terminé et le travail de drug design peut commencer.

L'affinement de divers complexes de la Tdt a été mené a bien et les résultats sont en phase d'écriture (collaboration avec F. Rougeon, IP). De nombreuses purifications de la Pol mu et des centaines d'expériences de cristallisation sont en cours pour essayer de résoudre la structure de la pol mu, une cousine de la TdT impliquée dans la recombinaison non-homologue. L'aide des Plateformes de Production de Protéines (PF5) et de Cristallogenèse (PF6) est grandement appréciée.

B. Modes Normaux et Biologie Structurale (E. Lindahl)

Le travail sur les Modes Normaux s'est poursuivi dans plusieurs directions: (a) Modes Normaux et affinement cristallographique, (b) Modes Normaux et affinement dans des données de microscopie électronique, (c) Modes Normaux et docking de petites molécules, (d) Modes Normaux et alignement structural.

La première partie a été publiée en 2004 tandis que la deuxième vient juste d'être soumise pour publication. De plus, une collaboration avec le groupe de J.P. Changeux (IP) sur l'application des modes normaux au récepteur nicotinique (pentamérique) a aussi donné lieu à une publication (soumise a Biophys. J.).

Un site web a été développe (lorentz.immstr.pasteur.fr) ou les outils d'affinement peuvent être utilisés en ligne et ou différents outils de modélisation ont aussi été rendu accessibles.

C. Structure du solvant et électrostatique (C. Azuara)

Un nouveau modele des interactions proteine-solvant a été développe, en collaboration avec H. Orland (CEA). Il permet de s'affranchir de l'hypothèse de milieux diélectriques continus de valeur constante; la densité du solvant autour du solute est variable. Un programme a été écrit pour résoudre les équations, d'abord par relaxation puis en utilisant la méthode multi-grille. Il sera aussi bientôt mis en ligne. Plusieurs applications sont en train d'être étudiées activement : incorporation de la polarisabilité de la protéine grâce aux Mode Normaux, dénaturation de protéines par l'urée en fonction de sa concentration, étude de la stabilité des protéines dans des solvants organiques, application à la cristallographie des protéines et comparaison avec des données expérimentales sur la densité électronique du solvant.

Mots-clés: biologie structurale, diffraction des rayons X, protéines kinases bactériennes, glycosidases et glycosyl transferases, tuberculose, Trypanosoma cruzi, polymérases, génomique structurale


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