Unité: Biologie des Régulations Immunitaires - INSERM E 352

Responsable: LECLERC Claude

L'activité de l'Unité est centrée sur la compréhension des mécanismes qui contrôlent l'activation et la régulation des réponses lymphocytaires T et sur la mise au point de nouvelles stratégies vaccinales. Nous avons développé plusieurs stratégies d'activation des réponses lymphocytaires T ainsi que des glycopeptides synthétiques portant des motifs saccharidiques afin d'induire des réponses anti-tumorales. De plus, nos travaux portent sur la compréhension de la biologie des cellules dendritiques, notamment chez le nouveau-né.

A. L'adénylcyclase de Bordetella pertussis : un nouveau vecteur ciblant les cellules dendritiques (C. Fayolle, L. Mascarell, X. Préville et G. Schlecht, en collaboration avec D. Ladant, Unité de Biochimie Cellulaire, et P. Sebo, Prague)

L'adénylcyclase (CyaA) est l'une des toxines essentielles de Bordetella pertussis et possède la capacité de pénétrer dans les cellules eucaryotes. Nous avons démontré que CyaA utilise l'intégrine CD11b/CD18 comme récepteur cellulaire. En utilisant des mutants et des fragments de CyaA, nous avons identifié la région de CyaA capable d'interagir avec CD11b. L'ensemble de nos résultats permet de concevoir un vecteur vaccinal capable de cibler une grande variété d'antigènes vers les cellules CD11b+ présentatrices d'antigène.

Ce nouveau vecteur a été utilisé pour développer un vaccin thérapeutique contre le cancer du col de l'utérus, associé à l'infection par certains papillomavirus (HPV). En collaboration avec la société BT Pharma, une start-up incubée à l'Institut Pasteur, nous avons construit des CyaA recombinantes portant la séquence complète de la protéine E7 de HPV16 ou des fragments de celle-ci. Injectées à des souris, ces protéines ont induit des réponses Th1 et CTL spécifiques. De plus, injectées à des souris porteuses de la tumeur TC-1 exprimant E7, ces protéines ont montré une très forte efficacité thérapeutique qui a permis la survie de 100% des animaux. Ces résultats ouvrent la voie à un essai clinique de ces molécules.

La protéine Tat du virus VIH-1 a également été insérée dans la CyaA (CyaA-E5-Tat) et sa capacité à induire des réponses humorales et cellulaires dirigées contre Tat a été étudiée. Les souris immunisées par la CyaA-E5-Tat développent des réponses anticorps anti-Tat neutralisantes élevées ainsi que des réponses cellulaires T CD8+. De plus, la polarisation de la réponse cellulaire induite contre Tat est de type Th1.

Nous avons de plus démontré que CyaA peut délivrer un épitope T CD4+ dans la voie de présentation de classe II, et ceci 100 à 1000 fois plus efficacement que la protéine native contenant cet épitope. Cette potentialisation de la présentation est abolie par le blocage de l'interaction entre CD11b et CyaA.

Nous avons développé une nouvelle approche qui consiste à lier de façon covalente des peptides synthétiques à CyaA. Ainsi, nous avons montré que des épitopes T CD8+ couplés chimiquement à CyaA induisent in vivo des réponses CTL spécifiques. Cette approche offre l'avantage de ne nécessiter qu'un seul vecteur auquel nous pouvons coupler par une réaction chimique simple tout peptide synthétique représentant un intérêt immunologique particulier.

La présentation préférentielle aux cellules T, CD4+ et CD8+, des Ag couplés à CyaA par les cellules dendritiques (CD) d'origine myéloïde nous a conduit à tester directement l'effet de la CyaA sauvage ou détoxifiée sur la maturation de ces cellules. L'analyse in vitro a permis de démontrer que l'incubation des CD dérivées de la moëlle osseuse avec de faibles concentrations de CyaA sauvage (pourvue de l'activité adénylcyclase) induit une augmentation de l'expression des molécules de CMH-I et II et de co-stimulation telles que CD80 (B7.1) et CD86 (B7.2) ainsi que celle du récepteur à l'IL-2 . A l'inverse, des CD incubées avec les mêmes doses de la CyaA détoxifiée conservent un phénotype immature. En parallèle, des expériences réalisées in vivo après injection i.v. avec une dose équivalente de CyaA sauvage et de CyaA détoxifiée (50 µg), dose suffisante pour activer des lymphocytes T CD8+ et CD4+, nous ont permis de confirmer que seule la CyaA sauvage conférait aux CD purifiées de la rate (CD11c+, CD11b+) un phénotype mature.

B. Etude des propriétés immunologiques des pseudo-particules virales du parvovirus (PPV-VLPs) (D. Briard, G. Moron et S. Hervas en collaboration avec P. Rueda, Madrid).

Les pseudo-particules virales du parvovirus (PPV-VLPs) produites par l'auto-assemblage de la protéine VP2 et portant des épitopes hétérologues sont capables d'induire de fortes réponses T CD4+ et CD8+ en l'absence d'adjuvant. Compte-tenu que les antigènes exogènes ne sont pas normalement délivrés dans la voie CMH-I, ces PPV-VLPs représentent un système très intéressant pour l'activation des réponses T cytotoxiques. Nous avons montré chez la souris que seules les cellules dendritiques capturent ces particules de façon très efficace in vivo et sont capables de présenter ces particules à des hybridomes T spécifiques. Conjointement, ces CD expriment les molécules de co-stimulation, CD40, CD80 et CD86, ainsi que la molécule CD8α . Les CD purifiés de souris injectées avec des PPV-VLPs sont capables de secréter de l'IL12p70 et de l'IFNγ. Les PPV-VLPs, après leur capture in vivo, sont localisés dans des endosomes tardifs et suivent une voie non conventionnelle d'apprêtage de type CMH-I, impliquant la macropinocytose, des protéases lysosomales, mais aussi le protéasome et les molécules TAP. En parallèle, nous étudions également la capacité des cellules dendritiques humaines à capturer ces pseudo-particules (en collaboration avec le groupe d'O. Schwartz) et nous cherchons à identifier un éventuel récepteur pour ces PPV-VLPs par des études de liaison ainsi que par microscopie confocale.

Nous avons également mis en évidence un fort effet adjuvant des PPV-VLPs après administration simultanée avec un peptide contenant un épitope T CD8+ couplé à des microsphères synthétiques. Les mécanismes responsables pour cet effet adjuvant sont en cours d'analyse.

Nous étudions les mécanismes du prime-boost (une nouvelle stratégie vaccinale qui consiste à faire des immunisations répétées avec différents vecteurs portant le même antigène pour induire une forte réponse immunitaire) en utilisant 2 vecteurs non réplicatifs, la toxine CyaA et les particules PPV-VLPs. Dans un premier temps, nous analysons les mécanismes de capture in vivo du vecteur PPV-VLPs dans différents organes lymphoïdes après une ou plusieurs injections de ces vecteurs afin de déterminer si l'immunité contre le vecteur affecte sa capacité à être délivrer aux CD.

C. Analyse des réponses CTL et Th induites par différentes sous-populations de cellules dendritiques (G. Dadaglio, G. Schlecht et J. Mouriès)

Il est maintenant parfaitement établi que les CD représentent les seules cellules présentatrices de l'antigène (CPA) capables d'induire des réponses immunitaires cellulaires primaires. Différentes sous-populations de CD peuvent être caractérisées suivant leur phénotype et leur fonction. Chez la souris, deux populations fortement positives pour le marqueur CD11c peuvent être distinguées par l'expression du marqueur CD8 et une autre population faiblement positive pour CD11c, correspondant aux CD plasmacytoides. La polarisation des réponses T auxiliaires CD4+ induites par les CD peut être contrôlée par différents facteurs tels que le microenvironnement cytokinique ou la dose d'antigène. La polarisation T peut aussi dépendre de la cinétique de maturation des CD. Afin de tester cette hypothèse, nous avons évalué et comparé l'état de maturation de CD fraîchement purifiées non traitées ou activées in vivo après leur injection dans des souris naïves. Nos résultats montrent que l'efficacité des CD non traitées à induire une réponse T CD4 est comparable à celle des CD préalablement activées. De plus, une forte production d'IFNγ est observée quel que soit l'état de maturation des CD suggérant que dans tous les cas une réponse de type Th1 est induite. Ces résultats démontrent que les procédures de purification induisent la maturation de CD conduisant à l'induction de réponse Th1 et que la polarisation des réponses T auxiliaires n'est pas dépendante de l'état de maturation des CD.

Les CD plasmacytoïdes (CDp) ont été récemment identifiées chez la souris. Pour caractériser leur fonction in vivo, des CDp immatures ou activées ont été purifiées et chargées de peptide antigénique restreint par les molécules de CMH-I, puis transférées dans des souris syngéniques naïves par voie intraveineuse. Les CDp immatures ou activées par du CpG n'induisent ni réponse cytotoxique spécifique de l'antigène ni activité régulatrice, suggérant que ces cellules ne sont pas capables d'initier des réponses T CD8+. Néanmoins, les CDp activées par le CpG sont capables de réactiver des cellules T mémoires in vivo. Par contre, suite à leur stimulation par du virus de la grippe inactivé, les CDp acquièrent la capacité d'activer des cellules T effectrices/mémoires spécifiques de l'antigène. Ainsi, les CDp se différencient en CPA professionnelles dans un contexte d'infection virale, ce qui montre qu'outre leur implication dans les réponses immunitaires innées, les CDp peuvent intervenir dans les réponses adaptatives anti-virales.

D. Ontogénie, fonctions et régulation des cellules dendritiques du nouveau-né murin (R. Lo-Man, CM. Sun et X. Zhang)

La période néonatale est caractérisée par une forte susceptibilité aux infections et par des réponses immunitaires de type Th2. Après avoir caractérisé le compartiment des cellules dendritiques au cours de la période néonatale, nous avons pu démontrer que celui-ci est pleinement fonctionnel. Toutefois, si les CD sont compétentes au cours de la période néonatale, leur environnement ne leur permet pas d'exprimer pleinement leur potentiel. En effet, nous avons pu montrer pour la première fois que, dans certaines circonstances, les cellules B néonatales peuvent contrôler la capacité des CD à induire des réponses T CD4+ de type Th1. Nous étudions actuellement les implications de ce schéma de régulation sur l'immunité du nouveau-né.

E. Etude des mécanismes de l'immunité anti-mycobactérienne (L. Majlessi, M. Rojas et S. Hervas en collaboration avec S. Cole et collaborateurs, IP)

L'induction des réponses immunes cellulaires de type Th1 contre les antigènes mycobactériens est essentielle dans la protection contre l'infection par Mycobacterium tuberculosis, l'agent étiologique de la tuberculose. Nous étudions la capacité du vecteur CyaA recombinant, portant des antigènes mycobactériens, comme vaccin sous-unitaire, à générer des réponses lymphocytaires T et à contrôler l'infection par M. tuberculosis. Les antigènes insérés dans le vecteur CyaA sont des protéines mycobactériennes connues pour leur forte immunogénicité chez l'homme et chez la souris ou une protéine mycobactérienne dont nous avons montré l'immunogénicité pour les compartiments T CD4+ et T CD8+ chez la souris. L'étude de ces vecteurs en tant que vaccins sous-unitaires contre l'infection par M. tuberculosis est actuellement en cours dans notre Unité.

En collaboration avec l'Unité de Génétique Moléculaire Bactérienne, nous avons montré que l'introduction d'une région chromosomique de M. tuberculosis, associée à la virulence, dans le génome de M. bovis BCG modifie profondément l'interaction entre le système immunitaire de l'hôte et les mycobactéries. Ainsi le BCG complémenté par cette région chromosomique induit, chez l'hôte, des recrutements préférentiels de cellules dendritiques et de lymphocytes T CD4+ et T CD8+ de type activé et effecteur. Ce BCG, contrairement au BCG parental, est capable d'induire in vivo au niveau des cellules dendritiques un programme d'inflammation en activant la production de chemokines et de cytokines inflammatoires.

Grâce à l'identification d'un immunogène mycobactérien parmi les rares reconnus par des CTL CD8+ de souris infectées par des mycobactéries et la génération d'hybridomes T spécifiques de cet immunogène et restreints par des molécules de CMH de classe I, nous caractérisons les mécanismes cellulaires et moléculaires de la présentation des antigènes mycobactériens par la voie de présentation CMH-I pour la génération des réponses T CD8+.

F. Elaboration d'un composé synthétique portant un motif saccharidique d'origine tumorale à des fins thérapeutiques et vaccinales (R. Lo-Man et E. Dériaud en collaboration avec S. Bay et S. Vichier-Guerre, Chimie Organique, IP)

Parmi les marqueurs saccharidiques associés aux cellules tumorales, on retrouve le motif Tn (alpha-N-acetyl-galactosamine) associé aux protéines de type mucine. Nous avons développé un immunogène synthétique utilisant la structure d'un MAP (multiple antigenic peptide) contenant ce motif Tn sous forme de trimère capable d'induire des réponses immunitaires anti-tumorales thérapeutiques. Ce MAG s'est révélé très immunogène et une vaccination thérapeutique réalisée avec ce composé permet de protéger les souris contre un adénocarcinome mammaire exprimant l'antigène Tn. Sur la base de ces résultats, nous avons développé des composés utilisables chez l'homme et démontré leur immunogénicité chez le primate non-humain.

L'activité de l'Unité est centrée sur la compréhension des mécanismes qui contrôlent l'activation et la régulation des réponses lymphocytaires T et sur la mise au point de nouvelles stratégies vaccinales. Nous avons développé plusieurs stratégies d'activation des réponses lymphocytaires T ainsi que des glycopeptides synthétiques portant des motifs saccharidiques afin d'induire des réponses anti-tumorales. De plus, nos travaux portent sur la compréhension de la biologie des cellules dendritiques, notamment chez le nouveau-né.

Mots-clés: Vaccin, cellules dendritiques, cancer, réponses T cytotoxiques, immunothérapie


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