Unité: Biologie et Génétique du Paludisme

Responsable: Robert Ménard

Notre laboratoire travaille sur Plasmodium, l'agent du paludisme, et plus particulièrement sur deux phases du cycle de vie du parasite qui sont des cibles de stratégies vaccinales. La première est la transmigration du parasite (ou ookinète) à travers la barrière intestinale du moustique. Cette phase est la cible de vaccins dits ‘altruistes', qui ne protègent pas l'individu vacciné mais bloquent la transmission du parasite. La seconde est la phase ‘pré-érythrocytaire'. Elle comporte le voyage du sporozoïte depuis le site de piqûre par le moustique jusqu'à un hépatocyte, ainsi que la différenciation intra-hépatocytaire du parasite dans la forme qui infectera les globules rouges et causera les symptômes de la maladie. Les vaccins pré-érythrocytaires visent à empêcher l'entrée du sporozoïte dans l'hépatocyte et/ou son développement intra-hépatocytaire. Notre approche est fonctionnelle, et consiste à caractériser les interactions hôte-parasite qui sont importantes pour la vie du parasite. Pour cela, nous étudions P. falciparum, l'espèce la plus pathogène pour l'homme, et P. berghei, une espèce qui infecte les rongeurs.

Plusieurs axes de recherche sont développés au laboratoire :

1. Caractérisation de gènes d'Anopheles gambiae dont l'expression est modulée par l'interaction du moustique avec Plasmodium falciparum (C. Lavazec, M. Gendrin, C. Bourgouin)

Au cours de son développement sporogonique précoce chez le moustique, le parasite franchit deux barrières : la matrice péritrophique et l'épithélium intestinal. Dans les conditions naturelles de transmission de P.falciparum, parasite de l'homme, une forte réduction parasitaire intervient dans la lumière intestinale de sorte que seule une dizaine d'oocystes arrivent à maturité. Nous avons caractérisé deux gènes codant des carboxypeptidases et démontré leur implication dans le développement de P. falciparum chez le moustique. En utilisant Plasmodium berghei, nos résultats suggèrent que ces carboxypeptidases pourraient constituer des composants d'un vaccin bloquant la transmission de Plasmodium. Par ailleurs, nous poursuivons l'analyse de banques d'ADNc construites par hybridation soustractive et suppressive pour identifier des gènes du moustique dont l'expression est modifiée lors des interactions entre les cellules digestives de A. gambiae et les ookinètes de P. falciparum.

2. Génomique fonctionnelle par ARN interférence chez An. gambiae (B. Boisson, J.-C. Jacques, C. Bourgouin, Programme GPH Anophèle)

Afin de pouvoir tester la fonction de produits du moustique dans les interactions avec Plasmodium, nous tentons de développer une approche d'inactivation de l'expression génique par interférence ARN (RNAi) basée sur l'inoculation d'ARN double brins dans l'hémolymphe de l'insecte. Nos résultats actuels suggèrent que l'efficacité de la méthode dépend du tissu cible ; alors qu'elle est permet d'éteindre l'expression de gènes exprimés dans le tube digestif ou les cellules en contact direct avec l'hémolymphe de l'insecte, elle semble incapable d'éteindre ceux exprimés dans les glandes salivaires, où sont stockés les sporozoïtes avant transmission au mammifère. Nous essayons maintenant de mettre en place la transgenèse à l'aide du transposon piggyBac, comme stratégie alternative pour inhiber l'expression de gènes de glandes salivaires chez Anopheles gambiae.

3. Imagerie in vivo du sporozoïte plasmodial (R. Amino, F. Frischknecht, B. Martin, R. Ménard, Programme GPH Anophèle)

Le sporozoïte naît d'un oocyste dans le tube digestif d'un moustique et ne peut poursuivre son développement qu'à l'intérieur d'un hépatocyte. En utilisant des sporozoïtes exprimant diverses protéines fluorescentes et en collaboration avec l'Unité d'Analyse d'Images Quantitative et le Centre d'Imagerie Dynamique, nous avons analysé chaque phase du processus in vivo dans un modèle rongeur. Cette étude a démontré l'importance de la mobilité in vivo de ces parasites non seulement pour l'invasion des cellules cibles, mais aussi comme moyen de locomotion chez le moustique et le mammifère. Elle a aussi révélé de nombreuses interactions hôte-parasite inattendues, notamment l'invasion des capillaires sanguins et lymphatiques dans la peau du mammifère, l'infection du ganglion lymphatique proximal, le glissement intra-vasculaire, et des interactions leucocyte-parasite complexes dans les capillaires sinusoïdes du foie. Nous tentons actuellement de caractériser les interactions entre les sporozoïtes et les ganglions drainants, ainsi que leurs conséquences sur l'infection parasitaire.

4. Développement et utilisation d'outils de mutagenèse conditionnelle chez >P. berghei (T. Gil Carvalho, S. Thiberge, A. Combe, D. Giovannini, R. Ménard)

Plasmodium est un terrain propice à la génétique inverse, en raison du taux élevé d'intégration d'ADN par recombinaison homologue et du caractère haploïde de son génome. L'utilisation de P. berghei offre les avantages de pouvoir disposer de la totalité du cycle parasitaire au laboratoire, analyser l'infection hépatique in vivo, et générer des mutants de façon plus aisée. Cependant, jusqu'ici toute manipulation du génome de Plasmodium ne pouvait être que constitutive, basée sur la transfection des stades érythrocytaires du parasite, et ne permettait pas d'étudier de nombreuses protéines parasitaires essentielles. Nous avons développé deux stratégies complémentaires de mutagenèse conditionnelle chez P. berghei, à l'aide du système de recombinaison spécifique de site Flp-FRT de la levure. Nous utilisons actuellement ces techniques pour comprendre la fonction, aux stades pré-érythrocytaires du parasite, de deux protéines essentielles aux stades érythrocytaires du parasite.

5. Génomique fonctionnelle de l'interaction parasite-hépatocyte (P. Baldacci, H. Sakamoto, S. Thiberge, S. Akerman, R. Ménard)

Une fois le sporozoïte dans une vacuole à l'intérieur de l'hépatocyte, il se transforme et génère des dizaines de milliers de mérozoïtes, le stade parasitaire qui infecte les érythrocytes et cause tous les symptômes de la maladie. Notre connaissance du processus de maturation du parasite dans le foie est limitée à quelques études descriptives, et seules quelques molécules parasitaires spécifiques des stades intra-hépatocytaires sont connues. Notre but est d'identifier les produits du parasite qui sont essentiels à son développement dans l'hépatocyte, et notamment ceux qui agissent à l'interface entre les deux cellules. Dans ce but, nous avons développé une stratégie de mutagenèse navette: un gène est mutagénisé par insertion d'un transposon (mini-Tn5) chez E. coli, et le fragment de remplacement obtenu est ensuite réintroduit chez le parasite où il remplace la copie sauvage du gène par un événement de double crossing-over (recombinaison homologue). Cette technique permet d'envisager une mutagenèse systématique de gènes plasmodiaux par la construction simultanée de plusieurs mutants dans une seule expérience de transfection. Nous utilisons actuellement cette approche pour tester la fonction de plusieurs dizaines de gènes spécifiquement exprimés par le parasite en position intra-hépatocytaire, sélectionnées par un crible bio-informatique.

Mots-clés: Plasmodium, Anophèle, paludisme, génétique moléculaire, génomique, imagerie in vivo


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