Unité: Repliement et Modélisation des Protéines - CNRS URA 2185

Responsable: GOLDBERG Michel

L'Unité combine la biologie cellulaire, la génétique, la biochimie et la physico-chimie des protéines pour étudier divers problèmes liés à leur structure, leur fonction et leur intégration dans divers processus cellulaires tels que l'acquisition de leur conformation fonctionnelle, les mécanismes de transmission moléculaire de la conformation anormale d'agents pathogènes non conventionnels (protéines "prion"), et les mécanismes cellulaires responsables de la propagation de ces agents pathogènes.

Une équipe de l'unité s'intéresse à la conformation de la protéine PrP dans le prion. Une seconde s'intéresse à la manière dont les prions se propagent dans l'organisme infecté pour atteindre le cerveau de l'animal et provoquer la maladie neurodégénérative. Une troisème équipe s'intéresse aux mécanismes moléculaires de reconnaissance et de régulation cellulaire liés à la présence de protéines bactériennes incorrectement repliées et, parallèlement à ces études fondamentales, développe des stratégies de clonage pour la production de protéines recombinantes.

1- Approche immunochimique de la conformation de la protéine PrP dans le "Prion" (M.-C. Blom-Potar, P. Bittoun, M. Cardona, P. Falanga, M. Goldberg et M. Hontebeyrie)

Le prion est l'agent infectieux responsable d'encéphalites spongiformes comme la tremblante du mouton, la Maladie de la Vache Folle, ou la maladie humaine de Creutzfeldt-Jakob. Le prion est constituté d'une protéine, la PrP, présente chez l'individu sain comme chez le malade. Cependant, la conformation (forme dans l'espace) de la PrP chez l'individu sain est différente de celle de la PrP dans le Prion. C'est cette différence que le groupe cherche à caractériser à l'aide d'anticorps spécifiques. Outre leur intérêt purement scientifique, ces recherches visent à l'amélioration de la sensibilité des tests de détection du prion chez les individus ou les animaux potentiellement infectés.

Après avoir mis en place tous les outils techniques et biologiques nécessaires à ces travaux et avoir isolé plusieurs clones cellulaires produisant des quantités importantes de la PrP, nous avons montré que ces lignées sont capables, après infection par une lignée de prions, de produire des quantités importantes de PrP sous une forme résistante aux protéases (comme le prion) et infectieuse. La cinétique de production de PrPSc (caractérisée par sa résistance aux protéases) après l'infection a été caractérisée, et la quantité de PrP totale et de PrP résistante produites par cette lignée ont été déterminées grâce à un test quantitatif mis au point au laboratoire. Nous avons ainsi montré que la lignée étudiée produit environ dix fois plus de PrP "pathologique" que la lignée initiale, ce qui rend possible la production, en culture cellulaire, de quantités de PrPSc de l'ordre du milligramme, suffisantes pour aborder une étude biochimique de cette forme de la protéine.

L'étude, que nous envisagions de faire, de la réactivité du prion vis-à-vis d'anticorps capables de se fixer à la partie structurée de la PrP pathogène, ne peut se faire sur le prion "naturel". En effet, à la partie purement protéique de la PrP naturelle sont attachées deux importantes structures moléculaires formées de sucres complexes qui, dans le prion, forment une "carapace" qui recouvre la protéine et le rend inaccessible aux anticorps. Nous avons donc cherché à éliminer ces sucres pour permettre l'étude conformationnelle de la protéine prion. Pour cela nous avions mis au point des conditions de culture de cellules productrices de PrP en présence d'un inhibiteur de glycosylation, permettant d'obtenir une préparation de prions "non-glycosylés". Ces conditions ont cette année été adaptées à la lignée hyperproductrice de prions, ce qui nous a permis d'obtenir en quantité significative des fibres amyloïdes de prions (SAFs) en grande majorité non-glycosylés, bien adaptées aux études immunochimiques et biochimiques de la protéine PrP dans le prion.

Le pouvoir infectieux de différentes préparations de PrP d'origine animale, ou obtenues en culture de cellules, a été analysé.

Par ailleurs, nous avons poursuivi la caractérisation de nombreux anticorps monoclonaux que nous avions produits en immunisant des souris à l'aide de peptides dérivés de la séquence peptidique de la PrP.

Enfin, nous avons tenté de déglycosyler la protéine PrP sous ses formes normale et pathologique en les traitant par une série d'exoglycosidases capables en principe de cliver les liaisons présentes dans les motifs glycosidiques de la PrP. La PrP, même sous sa forme soluble monomérique, s'est révélée très résistante à ces traitements. Cependant, cette étude nous a permis de mettre en évidence une activité protéolytique aboutissant à la perte de la région N-terminale non-structurée de la PrP, activité qui ne se manifeste qu'après traitement de la PrP par l'α-fucosidase. Plusieurs préparations de fucosidase d'origines différentes ont montré le même effet, suggérant que l'activité protéolytique n'est pas liée à un contaminant de la fucosidase. Ceci est d'ailleurs confirmé par le fait que la PrPc recombinante "native" préparée au laboratoire n'est clivée par aucune des fucosidases testées. De plus, la PrP recombinante s'est montrée résistante à la protéolyse même lorsqu'elle est mélangée à un extrait de cerveau dont la PrP endogène est clivée par la protéase-fucosidase-dépendante. La PrP endogène et la PrP recombinante native présentent donc des sensibilités différentes à cette activité protéolytique. L'origine moléculaire de cette différence reste à ce jour inexpliquée: S'agit-il d'une différence de conformation (dans ce cas, la forme supposée "native" de la PrP recombinante, qui est celle dont la structure tridimensionnelle a été déterminée par RMN ou rayons X serait différente de la forme de la PrPc naturelle…) ? Ou bien la protéase n'est-elle active que sur une forme partiellement glycosylée de la PrP (la PrP recombinante est, en effet, non-glycosylée) ? Il s'agit là d'une question importante, à laquelle notre groupe ne pourra pas malheureusement apporter de réponse, compte tenu de sa fermeture prochaine.

2- Physiologie de la neuro-invasion par les prions (C. Barnier, C. Cuche, C. Jacquemot, C. Vadrot et F. Lazarini)

Un des enjeux majeurs dans l'étude des maladies à prions reste la compréhension des mécanismes de propagation des prions par voie périphérique. Nous étudions les modes de propagation des prions depuis leur site d'entrée dans l'organisme jusqu'au système nerveux central (SNC), dans la variante de la maladie de Creutzfeldt-Jakob (MCJ) liée à l'épidémie d'encéphalopathie spongiforme bovine (ESB) ainsi que dans la MCJ liée à l'hormone de croissance contaminée. En utilisant un modèle murin, nous recherchons les cibles du prion de l'ESB parmi les cellules du système immun, notamment les cellules dendritiques ou macrophagiques. Nous recherchons également si des injections répétées et rapprochées de doses sous-infectieuses de prions par voie périphérique ont un effet cumulatif et peuvent induire cette maladie toujours fatale. Enfin dans le but de valider de nouvelles techniques de désinfection d'instruments chirurgicaux éliminant le risque prion, nous analysons les effets de plusieurs traitements physicochimiques vis-à-vis de l'infectiosité prion dans le modèle de la tremblante expérimentale de la souris.

3- Repliement des protéines dans le périplasme bactérien (N. Sassoon-Clavier, M. Miot et J.-M. Betton)

L'enveloppe d'Escherichia coli, comme toutes les bactéries Gram négative, comprend un compartiment extra cytoplasmique, le périplasme, délimitant les membranes interne et externe. Cette compartimentation cellulaire impose un contrôle du repliement des protéines périplasmique assez différent de celui qui est exercé via les chaperons et les protéases dans le cytoplasme de la bactérie. En effet, le périplasme ne contenant pas d'ATP, l'action coordonnée de ces facteurs du repliement est réalisée sans l'apport de cette source d'énergie.

Afin d'étudier le repliement des protéines périplasmiques, nous utilisons l'expression d'un mutant de la protéine affine du maltose ou MalE31, dont le repliement défectueux conduit à l'accumulation d'espèces protéiques incorrectement repliées, qui peuvent éventuellement s'agréger et former des corps d'inclusion, dans certaines conditions expérimentales. En combinant les approches génétique et biochimique, nous avons identifié un chaperon périplasmique de choc thermique FkpA, qui possède une activité enzymatique peptidyl-prolyle isomérase (PPIase), et qui appartient à la famille des protéines fixant l'immunosuppresseur FK506, ou FKBP. En collaboration avec l'Unité d'Immunologie Structurale dirigée par G. Bentley, nous avons résolu la structure tridimensionnelle de ce chaperon à 2 Å de résolution. FkpA est composé d'un homodimère dans lequel chaque monomère est constitué de deux domaines structuraux. Le domaine N-terminal contient trois hélices α entrelacées avec l'autre sous-unité pour former l'interface du dimère. Le domaine C-terminal, qui présente un motif structural commun aux FKBPs, fixe le FK506. Les deux domaines sont connectés par une très longue hélice α (49 résidus) qui procure à la molécule une grande flexibilité et lui donne une forme de V. Sur la base de cette structure, nous avons construit un variant de FkpA qui comprend une délétion complète du domaine C-terminal. Ce variant, en solution, existe en équilibre entre un état monomérique et dimérique, et possède la même fonction chaperon que la molécule entière, aussi bien in vivo qu'in vitro. Par contre, le domaine isolé FKBP est monomérique, et bien qu'il possède une activité PPIase comparable à celle de la molécule entière, ne présente aucune activité chaperon. Ces résultats démontrent clairement que les deux activités, chaperon et PPIase, de FkpA sont distinctes, et résident, respectivement, dans les domaines N- et C-terminaux. Nous poursuivons la caractérisation de FkpA en essayant de trouver les substrats physiologiques de ce chaperon périplasmique.

4- Protéases ClmP de Mycobacterium tuberculosis (N. Benaroudj et E. Johnson)

Les protéines Clp sont des protéases autocompartimentées et dépendantes de l'ATP, qui sont impliquées dans la survie et la virulence de nombreuses bactéries. Chez E. coli, les protéases Clp sont formées d'une sous-unité protéolytique, ClpP, et d'une sous-unité ATPasique, ClpA ou ClpX. Les sous-unités ClpP s'assemblent en tétradécamère, composé de deux anneaux héptamériques qui se superposent. Chez M. tuberculosis, ces protéases n'ont jamais été étudiées, mais le séquençage du génome a mis en évidence la présence de deux gènes codant pour les protéines ClpP (ClpP1 et ClpP2). Nous avons produit chez E. coli, purifié et initié la caractérisation des protéines ClpP1 et ClpP2 de M. tuberculosis. Nos résultats préliminaires indiquent que ces deux protéines, produites individuellement, ne sont pas capables d'hydrolyser des peptides et forment uniquement des complexes heptamériques dans les conditions expérimentales testées. Nous espérons mettre en évidence des spécificités dans les mécanismes d'action de ces protéases qui pourraient être reliées à une fonction dans la survie et virulence de M. tuberculosis. A plus long terme, nous étudierons aussi les protéines de stress, dont les chaperons moléculaires. En effet, M. tuberculosis possède des chaperons de la famille de DnaK et GroEL (déjà bien caractérisées chez E. coli), mais aussi de nouvelles protéines de stress dont la fonction est totalement inconnue.

5- Production de protéines recombinantes (J. Rogé et J.-M. Betton)

Grâce aux développements récents des systèmes de transcription-traduction acellulaire, nous avons développé une nouvelle stratégie de clonage-expression qui est basée sur la possibilité d'exprimer un gène in vitro à partir d'un produit PCR. Cette stratégie, automatisable, permet de tester, en quelques heures, l'expression de différentes combinaisons de séquences d'un même gène cible. Une fois cette étape préliminaire réalisée, le produit PCR qui donne un niveau d'expression satisfaisant est sélectionné, puis cloné dans un vecteur pour son expression cellulaire. Cette technique, qui permet une optimisation automatique des paramètres d'expression des gènes recombinants cibles, a été validée avec succès pour plusieurs protéines de Mycobacterium leprae. En collaboration avec A. Ghazi (Université d'Orsay), nous avons testé la possibilité de synthétiser des protéines membranaires dans un système de transcription-traduction acellulaire, en présence de détergents. Le canal mécanosensible MscL d'E. coli, qui forme un homopentamère, a été utilisé comme protéine membranaire modèle. Un grand nombre de détergents sont compatibles avec les réactions de transcription-traduction, et en présence de TritonX100 0,2 % la protéine MscL est produite à 1,5 mg/ml sous forme soluble. Après purification, nous avons montré par pontage chimique que la protéine est pentamèrique. Après reconstitution dans des liposomes, MscL ainsi produite in vitro présente des propriétés électrophysiologiques comparables à celles de la protéine produite chez la bactérie. Ce premier essai positif de production acellulaire d'une protéine membranaire nous a encouragé à tester d'autres protéines. Enfin, plusieurs protéines ou fragments de protéines de l'enveloppe du virus responsable du SRAS ont été produits également in vitro, et ensuite purifiés, dans le cadre d'une collaboration industrielle en vue de la mise au point de tests de diagnostics.

6- Production et étude d'une protéine recombinante, candidat vaccin contre le paludisme (A. Chaffotte et A.-G. Planson)

Le fragment C-terminal F19 de la protéine MSP1 (Merozoite Surface Protein) de Plasmodium falciparum est un candidat vaccin contre le paludisme. Nous cherchons à le faire produire en quantités importantes et à bas prix par la bactérie E. coli. Nous avons montré précédemment que ce fragment peut être obtenu sous forme native après clivage enzymatique spécifique contrôlé d'une protéine recombinante, constituée de la MBP (Maltose Binding Protein) fusionnée au fragment F19, et exprimée dans le périplasme bactérien. Lors de l'étude in vitro de l'effet d'assistance de MBP au repliement de F19 au sein de la fusion MBP-F19, nous avons défini des conditions particulières de repliement oxydatif complet du fragment isolé préalablement dénaturé et réduit. Cette propriété de repliement autonome de F19 in vitro ouvre la voie à la production en masse et à faible coût de ce fragment immunogénique à partir de son expression cytoplasmique dans E. coli.

7- Participation aux activités de la plateforme technologique de Biophysique des Macromolécules Biologiques (A. Chaffotte)

L'Unité assure la réalisation technique et la supervision scientifique (aide à la conception et à l'interprétation) des expériences de dichroïsme circulaire et de spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier, réalisées dans le cadre de la plateforme technologique. Elle a assuré l'hébergement et le contrôle de maintenace des équipements correspondants et activement participé au choix, à l'acquisition et à la mise en service d'un nouveau dichrographe.

8- Enseignement

L'Unité a la charge de l'organisation du Cours de Biochimie des Protéines (co-Directeurs A. Chaffotte et J-M. Betton) de l'Institut Pasteur associé au DEA de "Structure, Fonction et Ingénierie des Protéines" (Paris 6/ Paris 7/ Paris11/ ENS/ Polytechnique/ CEA), et plusieurs membres de l'Unité ont participé aux travaux pratiques de ce cours en 2004.

Mots-clés: Prion, déglycosylation, chaperon moléculaire, repliement, réponse aux stress


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