Unité: Biologie des bactéries pathogènes à Gram-positif

Responsable: Patrick TRIEU-CUOT

Notre activité de recherche a pour but l'élucidation des bases moléculaires de la virulence des bactéries à Gram positif à bas G+C%. En effet, une meilleure compréhension du scénario physiopathologie du processus infectieux doit permettre le développement de nouvelles thérapeutiques ou d'outils diagnostics innovants pour le traitement, la prévention ou le contrôle des infections dues à ces bactéries. Nous avons choisi Staphylococcus aureus et Streptococcuys agalactiae comme modèles de bactérie pathogène humain extracellulaire, et Listeria monocytogenes comme modèle de bactérie pathogène intracellulaire.

Nos principaux thèmes de recherche sont l'étude: 1) des structures de surface bactériennes (acides lipotéichoïques et protéines de surface) impliquées dans les interactions avec l'hôte), 2) de la régulation génique et de l'expression des gènes de virulence en relation avec la réponse au stress et l'adaptation environnementale (système de régulation à 2 composants).

Composants de la surface bactérienne impliqués dans la virulence

Durant, ou à la suite de leur translocation au travers de la membrane, le peptide signal des lipoprotéines est modifié par la diacylglyceryl transférase Lgt avant d'être coupé par la signal peptidase Lsp. Les gènes codant pour Lgt et Lsp ont été inactivés afin de déterminer la contribution des lipoprotéines dans la virulence de S. agalactiae et un double mutant Δlgt/lsp a également été construit. L'analyse par "Western blot" de 2 lipoprotéines types jouant le rôle d'adhésines (Lmb et ScaA) a révélé que ces protéines étaient uniquement détectées dans les fractions membranaires de la souche sauvage et du mutant Δlsp. Ces protéines étaient massivement relarguées dans le milieu de culture des mutants Δlgt et Δlgt/lsp et étaient absentes des fractions pariétale (membrane et paroi) et cytoplasmique des lysats bactériens correspondants. Les 3 mutants construits avaient une adhérence réduite à la fibronectine et au fibrinogène. Cependant, seuls les mutants Δlsp et Δlgt/sp adhéraient significativement moins aux cellules épithéliales humaines et avaient une virulence fortement diminuée dans le modèle du rat nouveau-né. Ces résultats suggèrent que Lsp est nécessaire à la biosynthèse de la forme active d'une (de) lipoprotéine(s) encore inconnue(s) qui est (sont) essentielle(s) pour la virulence de S. agalactiae.

L'incorporation des résidus D-Ala dans les acides lipotéichoïques (LTA) requiert l'activité de quatre protéines codées par l'opéron dlt: DltA est une ligase cytoplasmique qui catalyse la D-alanylation du D-alanyl transporteur DltC; DltB est une protéine transmembranaire qui est vraisemblablement impliquée dans l'efflux du D-Ala-DltC au site d'acylation; et DltD qui est une protéine dont la fonction et la localisation sont inconnues. La formation de D-Ala esters de LTAs contribue à la virulence de bactéries pathogènes à Gram positif extra- (S. agalactiae et S. aureus) et intracellulaire (L. monocytogenes) et les protéines DltA-D constituent de ce fait des cibles potentielles pour de nouveaux agents antibactériens. L'utilisation d'approches complémentaires nous a permis de montrer que: 1) DltD est ancrée dans le feuillet cytoplasmique de la membrane via son extrémité NH2-terminale, 2) que le carrier anionique DltC (pI = 3.9) est efficacement exporté vers le site d'estérification et pourrait être retenu dans la paroi par des interactions avec ses composants chargés positivement. DltC apparaît donc la seule cible extracellulaire facilement accessible à des inhibiteurs. Il reste à déterminer si le transfert du D-Ala sur le LTAs est catalysé par une enzyme.

Régulation génique et réponse au stress

Chez L. monocytogenes, le gène degU code pour un régulateur orphelin car son génome ne possède pas d'orthologue du gène degS codant l'histidine kinase normalement associée (système DegU/DegS) et ne code pas pour des histidine kinases orphelines. Une diminution significative (1 log) de la DL50 du mutant ΔdegU, par rapport à la souche sauvage EGDe, a été observée dans un modèle d'infection murin. Nous avons effectué l'analyse transcriptomique du mutant ΔdegU et montré que 81 gènes étaient régulés positivement par DegU alors que 6 étaient réprimés (Photo 1). La fonction de la majorité de ces gènes est inconnue et leur rôle dans le processus infectieux de L. monocytogenes est en cours d'élucidation. La protéine DegU de L. monocytogenes a été surproduite dans Escherichia coli et purifiée. Des expériences de retard sur gel et de protection à la DNAse I ont montré la fixation in vitro de la protéine DegU sur la région promotrice de son propre gène dont il régule négativement l'expression.

Le système de régulation à 2 composants CovS/CovR est un régulateur pléiotropique des gènes de virulence de Streptococcus pyogenes. Le système de régulation orthologue a été inactivé chez S. agalactiae et le mutant correspondant s'est révélé être hyper-hémolytique et hyper-adhérent à toutes les cellules épithéliales testées (A549, Hela, Caco-2 et L2) (Photo 2). Cependant, dans le modèle du rat nouveau-né infecté par voie intrapéritonéale, sa virulence était considérablement diminuée et nous avons montré qu'il était incapable de croître dans le sérum humain. L'analyse comparative du transcriptome de la souche sauvage et du mutant ΔCovS/CovR de S. agalactiae a montré que 76 gènes étaient réprimés alors que 63 étaient activés lorsque ce système de régulation était actif. La protéine CovR purifiée se fixe spécifiquement aux régions régulatrices de nombreux gènes régulés et une séquence consensus reconnue par CovR a été définie par des expériences de protection à la DNAse I et une analyse bioinformatique.

Nous avons étudié le rôle biologique et la régulation des gènes clp de S. aureus codant pour des sous-unités de la protéase ATP-dépendante Clp. Des expériences d'extension d'amorce et de protection à la DNAse I ont montré que la protéine CtsR de S. aureus contrôlait l'expression induite par le stress des gènes codant clpP, clpB et clpC en interagissant directement et spécifiquement avec leurs régions promotrices. Les protéines ClpP, ClpC, ClpB et ClpX, ainsi qu'à un degré moindre ClpL, sont nécessaires à la multiplication intracellulaire de S. aureus dans les cellules épithéliales de glande mammaire bovine MAC-T. En plus de l'expression des facteurs de virulence, la capacité à former des biofilms est une propriété essentielle de S. aureus, notamment en tant que pathogène responsable d'infection nosocomiale. De manière remarquable, la propension de cette bactérie à former des biofilms était significativement réduite dans un mutant ΔclpX ou ΔclpC alors qu'elle était accrue en absence de ClpP. Nos résultats indiquent que les complexes protéolytiques Clp contrôlent plusieurs processus clefs indispensables à l'expression de la pathogénèse de S. aureus.

Légendes des photos :

Photo 1: Exemple d'étude du transcriptome chez Listeria monocytogenes. L'ensemble des 3000 gènes du génome Listeria monocytogenes est présent sur une membrane à haute densité sous forme de fragments d'ADN double brin. Les points rouges indiquent les gènes dont l'expression est réprimée, les points verts ceux dont l'expression est activée, les points jaunes les gènes dont l'expression ne varie pas et les points noirs les gènes qui ne sont pas exprimés dans les conditions utilisées.

Photo 2: Phenotype du mutant du régulateur global ΔcovSR de S. agalactiae: hyper-hémolyse sur gélose au sang et hyper-adhérence sur cellules épithéliales.

Mots-clés: Bactéries Gram-positives, expression génétique, facteurs de virulence, réponses au stress, transduction de signal


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