Unité: Agents Antibactériens

Responsable: COURVALIN Patrice

L'Unité des Agents Antibactériens étudie le support génétique, les mécanismes biochimiques, l'expression hétérospécifique, l'évolution et la dissémination de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries pathogènes pour l'homme, notamment dans les systèmes suivants : entérocoques et glycopeptides, la résistance aux ß-lactamines et aux aminosides chez les bacilles à Gram négatif ainsi que le transfert de gènes des bactéries aux cellules de mammifères.

Résistance aux glycopeptides chez Enterococcus (Bruno Périchon et Florence Depardieu)

La résistance aux glycopeptides chez les entérocoques résulte de la production de précurseurs du peptidoglycane terminés par D-alanyl-D-lactate (D-Ala-D-Lac) (VanA, VanB et VanD) ou D-Ala-D-sérine (VanC, VanE et VanG) pour lesquels les glycopeptides présentent une faible affinité et de l'élimination de ceux terminés par D-Ala-D-Ala synthétisés par la ligase Ddl de l'hôte.

Résistance de type VanD

Les souches de type VanD sont constitutivement résistantes à la vancomycine et à de bas niveaux de teicoplanine par synthèse de précurseurs du peptidoglycane terminés par D-Ala-D-Lac. Nous avons étudié l'organisation du groupe chromosomique de gènes vanD de nouvelles souches de Enterococcus faecium et, pour la première fois, de E. faecalis et la régulation de leur expression. Chaque isolat clinique avait perdu l'activité D-Ala:D-Ala ligase chromosomique à la suite de diverses mutations dans la Ddl (E13G impliquée dans la liaison du D-Ala1, S319N de la sérine impliquée dans la liaison à l'ATP ou insertion de 7 pb). Les entérocoques résistants à la vancomycine ayant une ligase D-Ala:D-Ala non fonctionnelle ne poussent qu'en présence de vancomycine, puisque ces souches ont besoin de la voie de résistance inductible pour la synthèse du peptidoglycane. Chez les souches étudiées, il n'y avait pas de différence dans la nature des précurseurs du peptidoglycane produits par les cellules induites ou non induites, indiquant que le groupe de gènes vanD était exprimé constitutivement. Des mutations différentes dans le senseur VanSD (insertion de 7 pb ou délétion de 1 pb conduisant à la production d'une protéine tronquée) ou, pour la première fois, dans l'activateur de transcription VanRD (E140G dans le domaine effecteur) entraînaient l'expression constitutive de la résistance à la vancomycine.

Résistance de type VanB

Les souches de type VanB sont résistantes à la vancomycine et sensibles à la teicoplanine car ce dernier antibiotique n'est pas un inducteur. Des mutations dans le gène vanSB conduisent à l'expression constitutive ou inductible par la teicoplanine des gènes de résistance. Pour analyser l'expression des gènes van chez des lapins présentant une endocardite expérimentale, nous avons construit dans le chromosome d'une souche de E. faecalis de type VanB une fusion transcriptionnelle entre le promoteur PYB des gènes de résistance et le gène gfp mut1 de la GFP. Ce système rapporteur permet la détection de l'expression de la résistance aux glycopeptides au niveau d'une seule cellule bactérienne.

Résistance de type VanE

Les souches de type VanE sont caractérisées par une résistance de bas niveau à la vancomycine et une sensibilité à la teicoplanine. Trois nouvelles souches de E. faecalis possédant l'opéron vanE ont été isolées en Australie. L'expression des gènes de résistance est inductible dans deux de ces souches et constitutive dans la troisième, probablement à cause d'une délétion de 2 pb dans le gène vanSE aboutissant à un décalage du cadre de lecture et à la synthèse d'une protéine tronquée.

Résistance aux glycopeptides chez Staphylococcus aureus

Deux souches de S. aureus (MI-VRSA et PA-VRSA) résistantes à la méthicilline et aux glycopeptides ont été récemment détectées. Tandis que MI-VRSA est hautement résistante, PA-VRSA présente un bas niveau de résistance aux glycopeptides. Nous avons montré que l'expression de l'opéron vanA est élevée et similaire dans les deux souches. La résistance est stable chez MI-VRSA alors qu'elle est très instable chez PA-VRSA. L'induction de la résistance par la vancomycine est beaucoup plus lente chez PA-VRSA que chez MI-VRSA. Le bas niveau de résistance à la vancomycine de PA-VRSA est donc probablement dû à l'instabilité de l'élément génétique, plasmide ou transposon, portant l'opéron vanA associée à un long délai d'induction par la vancomycine.

Mise au point d'une PCR multiplex pour la détection de la résistance aux glycopeptides

Comme déjà indiqué, la résistance aux glycopeptides de type VanA a disséminé chez S. aureus résistant à la méthicilline; cependant, certains isolats cliniques ne sont pas détectés par les méthodes phénotypiques automatisées d'étude de la sensibilité in vitro. Aussi avons nous développé une PCR multiplex pour la détection des six types de résistance aux glycopeptides caractérisés chez les entérocoques et pour l'identification simultanée des principales espèces d'entérocoques et de staphylocoques. Les amorces correspondant aux gènes vanA, vanB, vanC, vanD, vanE, vanG, au gène ddl de E. faecium et de E. faecalis, au gène nuc spécifique de S. aureus et à une portion chromosomique spécifique de S. epidermidis ont été déterminées pour permettre l'amplification de fragments de taille variée en une seule réaction.

Détection des mutations dans des souches de Streptococcus pneumoniae résistantes aux fluoroquinolones par PCR-RFLP. (R. Alonso, M. Galimand)

La résistance aux quinolones chez S. pneumoniae est principalement due à des mutations dans les régions déterminant la résistance aux quinolones (QRDR) des sous-unités ParC de la topoisomérase IV ou GyrA de l'ADN gyrase. Nous avons développé une technique de PCR-RFLP afin de détecter les mutations dans les codons Ser79 et Asp83 du gène parC, Asp435 de parE et Ser81 et Glu85 de gyrA qui conduisent à une résistance aux quinolones.

S. pneumoniae CP1000 et 25 mutants obtenus in vivo et in vitro, avec des mutations connues dans les QRDR des gènes parC, parE et gyrA, ont été utilisés pour valider la technique. Les mutations dans parC étaient détectées en utilisant les enzymes de restriction HinfI [Ser79] et LweI [Asp83], celle dans parE [Asp435] avec HinfI et celles dans gyrA avec HinfI [Ser81] et MboII [Glu85], un site de reconnaissance artificiellement crée. Le produit d'amplification de 366 pb interne à parC de la souche CP1000 contient deux sites HinfI et un site LweI de coupure générant respectivement des fragments de 183, 127 et 56 pb et de 224 et 142 pb. La perte d'un site HinfI due aux mutations dans le codon Ser79 génère deux fragments de 183 pb qui migrent comme un doublet. Les mutations dans le codon Asp83 suppriment le site LweI et un fragment de 366 pb est observé. Le produit d'amplification de 290 pb interne à parE de la souche CP1000 contient deux HinfI générant des fragments de 166, 87 et 37 pb. La perte d'un des deux sites HinfI après mutation dans le codon Asp435 génère deux fragments de 203 et 87 pb. Le produit d'amplification de 183 pb interne à gyrA de la souche CP1000 contient un site HinfI naturel et un site MboII créé artificiellement qui génèrent respectivement des fragments de 113 et 70 pb et 141 et 42 pb. La perte du site HinfI chez les mutants résistants suite aux mutations dans le codon Ser81 donne un fragment de 183 pb. Les mutations au niveau du codon Glu85 étaient associées à la perte du site MboII conduisant également à un fragment de 183 pb. Cette nouvelle technique pourrait être un outil de criblage très utile pour les mutations les plus fréquentes et faciliter les études épidémiologiques sur la résistance aux quinolones des isolats cliniques de S. pneumoniae.

Résistance aux antibiotiques par efflux chez Acinetobacter baumannii (Laurence Damier-Piolle et Thierry Lambert)

La souche clinique de A. baumannii BM4454 était résistante à tous les aminosides et ne produisait pas d'enzyme inactivatrice de ces antibiotiques. Les gènes adeABC ont été identifiés et impliqués dans ce phénotype de résistance, ainsi que dans le niveau de résistance de base aux fluoroquinolones, tétracyclines, chloramphénicol, érythromycine et triméthoprime. Le produit du gène adeB est homologue aux protéines membranaires des systèmes " Resistance Nodulation cell Division" (RND) et les gènes adeA et adeC codent, respectivement, pour une protéine de fusion et une protéine de la membrane externe. Les protéines AdeA, AdeB et AdeC s'associent en un complexe tripartite pour former une pompe d'efflux de type RND qui expulse dans le milieu extracellulaire ces différents substrats. En amont de l'opéron adeABC, les gènes adeRS codent, respectivement, pour des protéines apparentées aux régulateurs et senseurs des systèmes à deux composants. L'inactivation de adeS a restauré la sensibilité aux aminosides. Des mutants résistants à la gentamicine, obtenus in vitro à partir de la souche de A. baumannii sensible CIP70-10, ont montré une expression constitutive de la pompe AdeABC. Ces mutants présentent soit la mutation Thr153->Met dans AdeS, soit la mutation Pro116->Leu dans AdeR. Ces données indiquent que l'expression de la pompe AdeABC est contrôlée par le système à deux composants AdeRS. Une autre pompe d'efflux AdeIJK a également été mise en évidence chez A. baumannii BM4454 et sa caractérisation est en cours.

Transfert à l'aide d'un vecteur bactérien de gènes et de protéines aux cellules de mammifères (C. Grillot-Courvalin et S. Goussard)

A l'aide du vecteur bactérien E. coli dap- BM2710 hébergeant le plasmide pGB2 inv-hly qui lui confère la propriété d'envahir les cellules eucaryotes non phagocytaires à condition qu'elles expriment l'intégrine ß1, nous avons pu mettre en évidence un transfert de gène et son expression dans des cellules différenciées de type épithélial bronchique. Le mécanisme et les conditions du transfert ont été étudiés dans des cultures primaires d'explants bronchiques en microscopie confocale et électronique. Le transfert de protéine hétérologue produite par le vecteur bactérien a pu être mis en évidence dans des lignées cellulaires en culture, HeLa et Caco-2, mais aussi in vivo chez la souris dans un modèle de tumeur. L'injection intra-tumorale de E. coli BM2710 pGB2 inv-hly a entraîné une réduction du volume des tumeurs chez les souris recevant la prodrogue 6-MPDR. Nous avons par ailleurs démontré que, dans certaines conditions, des promoteurs eucaryotes peuvent exprimer des gènes chez les bactéries.

Mots-clés: Bactériologie, antibiotiques, résistance, transfert de gènes


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