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     Virus Lents - CNRS URA 1930


  Responsable : BRAHIC Michel (mbrahic@pasteur.fr)


  resume

 

L'Unité a deux grands domaines d'activité : la neurovirologie et le SIDA. Nous étudions l'infection de la souris par le virus de Theiler, un des meilleurs modèles pour la sclérose en plaques. Nous étudions la façon dont le thymus réagit à l'infection par le VIH ainsi que la possibilité de traiter le déficit thymique grâce à l'IL-7. Nous développons un candidat vaccin contre le VIH en utilisant le vaccin rougeole Schwarz comme vecteur. Nous avons montré que ce vecteur pouvait induire une protection complète contre le virus du Nil occidental.



  rapport

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1- Pathogénie de l'infection par le virus de Theiler (Michel Brahic, Jean-François Bureau)

Le virus de Theiler, un picornavirus, infecte le système nerveux central de la souris de façon persistante. Le virus infecte d'abord les neurones, mais il persiste dans les cellules gliales de la substance blanche, en particulier dans les oligodendrocytes, cellules qui synthétisent la myéline, et dans les macrophages infiltrants. L'infection s'accompagne d'inflammation chronique et de lésions démyélinisantes qui ressemblent de près aux plaques actives de malades atteints de sclérose en plaques.

Les souris C3H shiverer et rumpshaker sont porteuses de mutations dans deux protéines de structure de la myéline (MBP et PLP). Ces souris sont résistantes à l'infection persistante, suggérant que l'oligodendrocyte et/ou la myéline joue(nt) un rôle clé dans la persistance. MBP et PLP sont aussi exprimées, à des taux très faibles, par les macrophages. La résistance pourrait donc être due aussi à des altérations de l'interaction virus/macrophage. Cependant, in vitro, nous avons observé que les oligodendrocytes et les macrophages des souris C3H et des souris mutantes ont la même permissivité au virus. La résistance pourrait donc être liée aux anomalies structurales de la myéline des souris mutantes, une hypothèse que nous testons à l'aide de cultures mixtes de neurones et oligodendrocytes qui myélinisent in vitro.

La sensibilité des souris à l'infection persistante et à la maladie démyélinisante est multigénique. Les différences de sensibilité sont principalement liées au contrôle de la charge virale par le système immunitaire. Tmevp3 est un locus de sensibilité que nous avons identifié sur le chromosome 10. Il fait partie d'un groupe de gènes de cytokines, qui comprend l'interféron gamma et l'IL-Tif/IL-22. Aucun polymorphisme entre souris sensibles et résistantes n'a été trouvé dans les régions codantes de ces gènes, ce qui suggère que l'effet de Tmevp3 est dû à des différences dans la régulation de l'expression de ces gènes. Les résultats que nous avons obtenus sur des lymphocytes ex vivo sont en faveur de cette hypothèse. Il est à noter que l'équivalent humain de Tmevp3 a été impliqué dans la sensibilité à plusieurs maladies auto-immunes, y compris la sclérose en plaques.

2- Mise au point de vaccins bivalents dérivés du vaccin contre la rougeole (Frédéric Tangy).

Les souches atténuées du virus de la rougeole sont des vaccins très efficaces et très sûrs qui peuvent être transformés en vecteurs pour exprimer des gènes étrangers. Nous utilisons ces vecteurs pour tenter de mettre au point un vaccin pédiatrique bivalent contre la rougeole et le VIH.

La souche vaccinale Schwarz a été clonée et transformée en vecteur par addition de deux unités de transcription supplémentaires. Des vaccins recombinants exprimant différentes formes des protéines Gag, Pol et Nef du VIS, ainsi qu'Env et Tat du VIH ont été construits. Ils induisent de fortes réponses humorales et cellulaires contre les protéines VIS et VIH chez des souris transgéniques pour le récepteur de la rougeole.

Les régions codant pour les boucles hypervariables V1, V2 et V3 du gène env du VIH 89.6 ont été délétées isolément ou dans différentes combinaisons. Les gènes délétés ont été introduits dans le vecteur rougeole. Ces constructions induisent des réponses T et des anticorps neutralisants après une seule injection à des souris transgéniques. Les sérums neutralisent 90-100% de l'infectivité d'isolats primaires du VIH à la dilution 1/100. Ces taux sont supérieurs à ceux de sérums humains neutralisants de référence. Après 2 injections, les taux d'anticorps anti-VIH obtenus chez des souris naïves et des souris pré-immunisées contre la rougeole sont comparables. Le même résultat a été obtenu chez des singes macaques un an après la pré-immunisation contre la rougeole. Ces résultats indiquent que des vaccins rougeole recombinants pourraient être utilisés chez des individus possédant déjà une immunité anti-rougeole.

Une expérience d'immunisation/épreuve a été réalisée chez 12 macaques avec un mélange de vecteurs rougeole exprimant les protéines Gag, Env, Tat, Nef du virus chimérique SHIV89,6. De fortes réponses cellulaires ont été obtenues chez tous les singes, et des anticorps neutralisants chez certains d'entre eux. De fortes réponses anamnestiques cellulaires et humorales ont été observées après inoculation du virus SHIV89.6 à ces animaux vaccinés. Quatre des six animaux vaccinés ont eu des charges virales plus faibles que celles des animaux contrôles lors de la primo-infection. L'effet de la vaccination sur l'immunodéficience induite à long terme par le virus d'épreuve est en cours d'étude.

Nous étudions aussi des vaccins rougeole recombinants exprimant des protéines de flavivirus (virus de la dengue, du Nil occidental, de la fièvre jaune, de l'encéphalite japonaise). Nous avons montré que le vecteur Schwarz exprimant la protéine d'enveloppe, sous sa forme secrétée, du virus du Nil occidental induisait une immunité protectrice stérilisante 8 jours après une seule injection. Les animaux restent protégés à long terme. Ce candidat vaccin est actuellement testé chez le primate.

3- Fonction thymique au cours de la primo-infection par le VIH/SIV (Rémi Cheynier)

Le thymus joue un rôle majeur dans l'homéostasie des populations lymphocytaires T naïves de l'adulte et dans les processus de reconstitution immunitaires, en particulier chez les patients infectés par le VIH-1 et traités par trithérapie. La production de lymphocytes T par le thymus peut être suivie en quantifiant un sous-produit du réarrangement des gènes du récepteur T. Cependant la fréquence de ces molécules d'ADN dans les lymphocytes T circulants dépend aussi de la prolifération périphérique des cellules T naïves. Nous avons mis au point une méthode originale qui permet de quantifier les cellules récemment émigrées du thymus (RTE), indépendamment des phénomènes de proliférations périphériques. Grâce à cette nouvelle technique, nous avons montré que la thymopoïèse était massivement inhibée au cours de la primo-infection par le VIH-1, en particulier chez les patients jeunes, et qu'elle était partiellement restaurée par les traitements antiviraux.

Nous avons montré, en collaboration avec l'équipe de Nicole Israël (Unité de Biologie des Rétrovirus), que l'injection d'interleukine 7 (IL-7) à des macaques traités par des antiviraux au cours de la primo-infection SIV, augmentait significativement la population de lymphocytes T naïfs périphériques. Cet effet est dû en partie à la prolifération des cellules T naïves périphériques mais surtout à une stimulation de la production thymique. Ces résultats laissent espérer que le même traitement puisse aussi avoir un effet chez les patients infectés par le VIH.

Légendes des photos :

Photo 1

Des souris C3H ont été infectées avec la souche DA du virus de Theiler et sacrifiées 11 jours plus tard. Les souris ont été perfusées avec du formaldéhyde; la moelle épinière a été disséquée, et des coupes congelées de 10 µm ont été préparées. A : La coupe a été post-fixée dans l'acétone puis colorée avec un anticorps antivirus (vert), un anticorps spécifique des macrophages (CD11b, rouge) et du DAPI (bleu). B : La coupe a été post-fixée dans l'éthanol puis colorée avec un anticorps antivirus (rouge) et un anticorps spécifique des oligodendrocytes (CNPase, vert). Les images ont été obtenues avec un objectif x63 et un microscope équipé du système ApoTome.

Photo 2

Un oligodendrocyte myélinise un axone à proximité dans une culture mixte myélinisante. L'oligodendrocyte est coloré avec un anticorps anti-PLP (rouge) et l'axone avec un anticorps anti-Smi-31 (vert). Les noyaux sont colorés en bleu (DAPI).

Photo 3

Virus de la rougeole (souche vaccinale Schwarz) exprimant les protéines d'enveloppe du HIV

Mots-clés: Virus de Theiler, Vaccin anti-VIH, Virus neurotropes, Thymus, Pathogénie



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  GAU Mireille (mgau@pasteur.fr) BRAHIC Michel, CNRS/IP (Directeur de Recherche I, Professeur, mbrahic@pasteur.fr)

BUREAU Jean-François, IP (Chef de Laboratoire, jfb@pasteur.fr)

CHEYNIER Rémi, IP (Chargé de Recherche, remi@pasteur.fr)

FEVRIER Michèle, CNRS (Chargée de Recherche I, mfevrier@pasteur.fr)

TANGY Frédéric, CNRS (Directeur de Recherche II, ftangy@pasteur.fr)

BEQ Stéphanie, Post-doc

GAUTIER David, Thèse

GUERBOIS Mathilde, Thèse

KARACHTCHOUK Galina, Post-doc

LORIN Clarisse, Thèse

MAS Magali, Post-doc

ROUSSARIE Jean-Pierre, Thèse

TRAN Estelle Thi-Lan, DEA

VOLMER Romain, Thèse

COMBREDET Chantal (Technicienne Supérieure de Laboratoire, combred@pasteur.fr)

LEVI-ACOBAS Fabienne (Technicienne Supérieure de Laboratoire, flacobas@pasteur.fr)

LEVILLAYER Florence (Technicienne Supérieure de Laboratoire, flevilla@pasteur.fr)

NAJBURG-LABROUSSE Valérie (Technicienne Supérieure de Laboratoire, vlabrous@pasteur.fr)

SYAN Sylvie (Technicienne Supérieure de Laboratoire, ssyan@pasteur.fr)


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