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     Virologie moléculaire et vectorologie


  Responsable : Pierre Charneau (charneau@pasteur.fr)


  resume

 

L'essentiel de nos recherches porte sur l'étude des étapes précoces de la réplication des lentivirus, en particulier sur les mécanismes d'import nucléaire du génome VIH-1. La connaissance de ces mécanismes fondamentaux est appliquée à la mise au point de vecteurs lentiviraux de transfert de gène efficaces. Ces nouveaux vecteurs ouvrent de nombreuses applications de thérapie génique (développées en collaborations) et se révèlent également de puissants outils vaccinaux contre le SIDA lui-même mais aussi d'autres virus et certaines tumeurs (développement interne).



  rapport

cale

L'import nucléaire actif des génomes lentiviraux, via le routage puis la translocation des complexes viraux à travers les pores nucléaires du noyau interphasique, leur permet d'infecter des cellules non-mitotiques. Nous avons montré précédemment que l'import nucléaire du génome VIH-1 obéit à des mécanismes originaux: la présence de deux séquences cis-actives centrales (cPPT et CTS), à l'intérieur du génome VIH est responsable de la synthèse d'une structure ADN à trois brins (ADN flap) agissant comme déterminant cis-actif de l'import nucléaire de l'ADN viral.

Virologie fondamentale

La séquence ADN flap présente dans le génome VIH-1, ainsi que dans tous les génomes lentiviraux, est un déterminant cis-actif de l'import nucléaire du génome VIH-1. Une part importante de nos projets de recherche vise à comprendre par quel mécanisme moléculaire précis l'ADN flap est impliqué dans l'import nucléaire du génome VIH-1.

Nous avons récemment montré que la terminaison centrale, ultime étape de la rétro-transcription formant l'ADN flap, induit la maturation du complexe de rétro-transcription (RTC) en complexe de pré-intégration, libéré de l'assemblage de protéines de capside et d'une taille compatible avec la translocation par le pore nucléaire. Nous avons par ailleurs identifié par microscopie électronique à transmission (TEM), à balayage (SEM), et par Cryo SEM, l'ultrastructure des complexes VIH-1 intracellulaires (coll. T. Allen et M.C. Prévost).

Il est aussi possible que la structure ADN flap recrute des ligands protéiques, d'origine virale ou cellulaire, possédant des signaux de localisation nucléaire, et permettant ainsi l'initiation de la translocation du filament d'ADN à travers le pore nucléaire. Nous adoptons diverses approches expérimentales afin d'identifier ces protéines "navette".

Afin de pouvoir visualiser de manière quantitative les étapes précoces de l'infection par le VIH-1, et ce jusqu'à intégration du provirus dans l'ADN cellulaire, nous avons mis en place un système d'imagerie dynamique et de "tracking" en 4D (coll. S. Shorte et J.C. Olivo-Marin) du virus VIH-1, qui, par un marquage fluorescent de l'intégrase, permet le suivi dynamique de l'ADN viral dans les cellules infectées vivantes. Ces travaux nous ont fourni des données complètement nouvelles sur les caractéristiques cinétiques des différents mouvements présentés par les complexes VIH-1 dans le cytoplasme et dans le noyau de cellules infectées. Ils nous ont également fourni un outil puissant pour l'étude des interactions cellule hôte/virus durant l'infection.

Vectorologie et transfert de gène

Un intérêt grandissant est porté aux vecteurs lentiviraux de transfert de gènes dans tous les domaines de la thérapie génique. Nous avons montré que l'introduction dans les constructions lentivirales de la structure ADN flap stimule fortement le transfert de gène dans toutes les cellules ou tissus étudiés ex vivo ou in vivo (cellules souches hématopoïétiques, cerveau, foie etc.). Les "vecteurs lentiviraux flap" ont la capacité de transduire des cellules non-mitotiques, solutionnant ainsi un des principaux problèmes pour l'efficacité de transfert de gène lié aux vecteurs rétroviraux " classiques " dérivés du virus de Moloney. Par ailleurs, de nombreux types cellulaires peu permissifs ou même réfractaires à la transfection sont désormais transduits stablement avec une efficacité proche de 100%. C'est le cas par exemple des hépatocytes primaires, des astrocytes, des lymphocytes T, des macrophages et des cellules dendritiques.

Notre objectif a été, et continue d'être, d'établir les conditions optimales pour le transfert de gène in vivo ou ex vivo en cellules et tissus d'intérêt thérapeutique majeur, comme le cerveau, le foie, et les cellules souches hématopoïétiques, pour lesquels nous avons déjà montré des efficacités de transduction décuplées après incorporation dans le vecteur lentiviral de l'ADN flap. Des projets de thérapie génique de maladies complémentables par transfert de gène dans les cellules souches hématopoïétiques, comme les leucodystrophies (coll. N. Cartier) sont engagés. Par ailleurs, suite aux récents effets secondaires graves rencontrés avec l'utilisation de vecteurs rétroviraux dérivés du Moloney dans l'essai SCID-X1, nous participons actuellement à la mise en place d'un protocole de thérapie génique des maladies " enfants bulles ", rendu plus sûr grâce à l'utilisation de vecteurs lentiviraux (coll. A. Fischer et M. Cavazzana).

Vectorologie fondamentale

Nous entreprenons l'optimisation des paramètres de construction et de production des vecteurs lentiviraux dérivés du VIH-1 incluant l'ADN flap. Parmi nos travaux sont la mise au point d'une nouvelle génération de vecteurs lentiviraux incluant un ADN flap symétrique, et des unités transcriptionelles PolII ou PolIII insérées dans la région U3; le choix de promoteurs adaptés aux types cellulaires étudiés; la production de particules vecteurs par une lignée d'encapsidation stable optimisée; et l'optimisation des techniques de titration des vecteurs par PCR quantitative. Enfin, une priorité importante de nos travaux a été, et demeure, l'optimisation du "design" des vecteurs lentiviraux en vue de l'augmentation de la sécurité liée au transfert de gène.

Nous avons par ailleurs mis en place un système de vectorisation de siRNAs en vecteurs lentiviraux nous permettant d'induire une interférence stable en cellules transduites de manière reproductible et peu onéreuse, ainsi que la génération rapide d'animaux transgéniques " knock-down " (coll. C. Gouget et P. Avner).

Vaccinologie

La capacité des vecteurs lentiviraux de transduire avec efficacité les cellules du système immunitaire et plus généralement les cellules présentatrices d'antigène (cellules dendritiques, DCs) en fait un outil clé pour le développement de protocoles de vaccination anti-virale et anti-tumorale.

Nous travaillons en premier lieu sur un protocole optimisé de vaccination thérapeutique anti-VIH-1 par vecteur lentiviral codant pour des polyépitopes VIH-1 restreints par HLA-A2 ou -B7. Celui-ci nous permet de générer, après injection unique chez les souris "humanisées" HLA-A2 ou-B7, une réponse T primaire forte et multi-spécifique ainsi qu'une réponse mémoire efficace. Les vecteurs lentiviraux ont l'avantage de permettre la transduction stable de DCs, induisant ainsi une présentation d'antigènes persistant pendant toute la durée de vie des DCs in vivo. Cette présentation se fait à la fois sur les MHC de classe I par la voie endogène et, par cross-présentation des épitopes GAG/POL du vecteur, sur les MHC de classe II. Ceci ce qui permet une stimulation à la fois des lymphocytes T CD8 (CTL) et CD4. Par ailleurs, les vecteurs lentiviraux ont un tropisme naturel pour les DCs in vivo: une injection sous-cutanée unique de particules vecteur est équivalente, voire supérieure en efficacité de stimulation de réponse T à un protocole de ré-infusion de DCs transduites ex vivo, beaucoup plus lourd.

Nous concentrons nos études également sur d'autres modèles viraux, notamment les virus du West Nile et de la Dengue (coll. P. Desprès), du SRAS et de la grippe (coll. S. Van Der Werf), et de la Valée du Rift (coll. M. Bouloy). Dans le cas du virus du West Nile (WNV), nous avons montré qu'un vecteur lentiviral codant pour la protéine d'enveloppe induit dans un modèle souris une réponse immunitaire 100% protectrice dès 7 jours post-injection contre un challenge létal, et ce, à des doses infimes de particules vecteur.

Dans le contexte de la vaccination anti-tumorale, nous avons montré qu'une injection unique en souris HLA-A2 de particules vecteur lentiviral codant pour un polyépitope mélanome induit une réponse CTL forte et multi-spécifique contre les épitopes mélanome.

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  ZIANI Isma iziani@pasteur.fr   ARHEL Nathalie, post-doc ANRS, arhel@pasteur.fr

BEIGNON Anne-Sophie, post-doc RFM, asb@pasteur.fr

COURBEYRETTE Karine, stagiaire ingénieur CNAM, kmollier@pasteur.fr

IGLESIAS Maria Candela, étudiante en thèse CONACYT, candela@pasteur.fr

SOUQUE Philippe, Ingénieur, psouque@pasteur.fr

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