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     Toxines et Pathogénie Bactérienne - l’URA 2172 du CNRS


  Responsable : Michèle MOCK (mmock@pasteur.fr)


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Bacillus anthracis est l'agent de la maladie du charbon. La virulence de B. anthracis nécessite simultanément la synthèse de toxines et la formation d'une capsule. Les recherches portent sur : le rôle des toxines au cours de l'infection, leur mode d'action cellulaire, la contribution des structures de surface de la spore et de la bactérie dans l'interaction de ce pathogène avec l'hôte. Dans le domaine de la vaccination anti-charbonneuse, une composition vaccinale efficace, à usage humain, a été mise au point. Les mécanismes de protection impliqués sont analysés.



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La surface de la spore

(Patricia Sylvestre - Evelyne Couture-Tosi - Michèle Mock)

La spore est à la fois la forme de persistance de B. anthracis dans l'environnement et la forme infectante qui enclenche l'infection après germination dans l'hôte. La structure la plus externe de la spore, l'exosporium, et son rôle dans l'interaction précoce avec l'hôte ainsi que sa contribution éventuelle dans l'immunoprotection sont analysés. Une glycoprotéine, nommée BclA (pour Bacillus collagen-like), a été identifiée comme le composant structural des filaments localisés à la surface de l'exosporium. BclA contient une région interne (CLR) présentant une forte similitude avec les molécules de collagène mammifère. La région CLR est composée de répétitions de triplets GXX. Le nombre de répétitions GXX varie considérablement entre les souches qui ont été analysées et nous avons montré que la variation de la taille du CLR est directement responsable de la variation de la longueur des filaments de BclA. La caractérisation d'autres composants structuraux de l'exosporium ainsi que des protéines participant à la mise en place et à la glycosylation de BclA est en cours.

Toxines de Bacillus anthracis - Approches vaccinales et thérapeutiques

(Pierre Goossens - Ian Glomski - Michèle Mock)

Bacillus anthracis produit deux toxines composées de trois protéines : la toxine létale (PA + LF) et la toxine œdématogène (PA + EF). PA (antigène protecteur) est le composant commun qui permet de fixer et de délivrer EF (facteur œdématogène) et LF (facteur létal) dans les cellules eucaryotes cibles. EF est une adénylcyclase calmoduline-dépendante et LF, une métalloprotéase qui agit spécifiquement sur la famille des MAPKKinases. Des inhibiteurs spécifiques de l'activité enzymatique de LF et EF ont été trouvés et leur intérêt thérapeutique au cours de l'infection apparaît prometteur. Des approches immunothérapeutiques sont également explorées avec succès. Certains anticorps monoclonaux obtenus envers PA et envers LF, bloquant soit la fixation de PA sur le récepteur soit la formation du complexe PA-LF, sont neutralisants de l'activité de la toxine létale et protecteurs, chez la souris, envers une infection avec la souche Sterne (productrice de toxines). En situation d'urgence, ces anticorps, à haute affinité, peuvent offrir une possibilité thérapeutique intéressante en complément d'un traitement antibiotique, lorsque la toxémie est déjà élevée.

Par ailleurs, nous développons un projet d'amélioration du vaccin à usage humain. En effet, celui mis au point dans les années 60, basé sur l'immunité envers les toxines via PA, est peu satisfaisant. Notre travail montre que l'adjonction de spores inactivées à PA augmente considérablement l'efficacité protectrice de ce vaccin, la rapprochant de celle du vaccin vivant. D'après les tests d'efficacité déjà réalisés sur modèles animaux, cette formule vaccinale offre des perspectives pour l'amélioration de la vaccination humaine. L'analyse des mécanismes de protection induits par ce protocole de vaccination est réalisée. Nous avons ainsi développé un modèle d'infection cutanée chez la souris de façon à caractériser, d'une part l'infection, localement, au niveau du site infecté, et d'autre part les mécanismes de dissémination à distance vers le/les ganglion(s) drainant(s) et dans l'organisme en son entier. La comparaison de ces événements chez l'hôte naïf et chez l'hôte immunisé nous permet de poser des hypothèses précises sur les mécanismes pouvant être mis en œuvre pour contrôler l'infection. En collaboration avec le CRSSA, un modèle d'infection par aérosol et par voie intranasale a été mis en place pour étudier l'efficacité de la vaccination sur une infection par voie respiratoire, ceci dans le cadre de la lutte contre le bioterrorisme.

A côté de l'étude de la réponse adaptative à la vaccination, nous étudions les mécanismes de l'immunité innée qui pourraient intervenir dans le contrôle précoce de la germination et de la dissémination de B. anthracis. Nous avons montré que la phospholipase A2 de type IIA, sécrétée par les macrophages alvéolaires et les neutrophiles, exerce une activité bactéricide vis-à-vis de B. anthracis, que ce soit sur les spores germées ou les bacilles capsulés. Son implication in vivo est en cours d'étude. Par ailleurs, nous analysons in vitro et in vivo des interactions entre les spores de B. anthracis et les cellules dendritiques (travail conjoint IP/ CRSSA). En particulier, le rôle respectif de chaque toxine produite au cours de l'infection sur le profil de sécrétion des cytokines et chemokines, ainsi que sur les cascades de signalisation intracellulaire, est étudié, grâce à l'utilisation de différentes souches mutantes dans les facteurs de virulence.

La surface du bacille

(Agnès Fouet - Evelyne Couture-Tosi )

Les bacilles isolés d'animaux malades du charbon sont capsulés. La capsule recouvre une couche structurée formant un réseau, appelée couche S. Cependant, capsule et couche S peuvent être synthétisées indépendamment. La capsule a un rôle antiphagocytaire. Au moins trois protéines dont les gènes sont organisés en opéron, interviennent dans la synthèse de la capsule. Une quatrième protéine, dont le gène fait aussi partie de cet opéron, intervient dans la dégradation de l'excès de capsule. Cette protéine catalyse également l'ancrage covalent de la capsule au peptidoglycane.

Deux protéines abondantes peuvent constituer la couche S. Une seule de ces protéines semble être synthétisée chez l'hôte. Un régulateur commun intervient pour contrôler la synthèse des composants des toxines, des composants de la couche S et des protéines de biosynthèse de la capsule. Les protéines de couche S possèdent, dans leur région N-terminale, un domaine qui permet l'ancrage à un polysaccharide associé au peptidoglycane. Ce mécanisme d'ancrage non covalent est retrouvé dans de nombreuses espèces bactériennes.

Un autre mécanisme d'ancrage de protéine de surface a été décrit dans de nombreux pathogènes à Gram+. Des " sortases " catalysent l'ancrage covalent de protéines portant le motif LPXTG au peptidoglycane. Ce mécanisme existe chez B. anthracis qui possède trois sortases. Des mutants ont été construits pour chacun des trois enzymes et leur virulence est actuellement testée.

Analyse génomique et transcriptionnelle

(Maryse Moya-Nilges - Odile Mary-Possot - Agnès Fouet)

B. anthracis, B. cereus et B. thuringiensis appartiennent au groupe B. cereus. Une analyse génétique approfondie a montré que ces trois bactéries sont en fait une même espèce.

La séquence génomique de la souche Ames de B. anthracis et celle de plusieurs souches de B. cereus sont disponibles. L'accès à de nouveaux outils de traitement informatique nous a permis de réaliser une annotation du génome mieux adaptée à une réelle analyse fonctionnelle. L'analyse par transcriptome vise à définir les gènes spécifiquement exprimés chez l'hôte au cours du développement bactérien. L'étude est engagée par l'analyse, dans différentes conditions de culture, des gènes controlés par AtxA, régulateur commun intervenant dans la synthèse des toxines, de la capsule et de composants de surface. AtxA induit la synthèse de PagR, lui même régulateur pléiotrope. Les gènes controlés par PagR font donc également l'objet de cette étude 

Phylogénie et écologie de B. anthracis

( Patricia Sylvestre - Michèle Mock)

Le charbon est une zoonose des mammifères de répartition mondiale qui a considérablement régressé dans les pays occidentaux depuis la fin du siècle dernier. Néanmoins, le charbon existe toujours en France où il apparaît, chaque année, de façon sporadique dans diverses régions. Des études phylogénétiques sur une collection de souches françaises de B. anthracis, collectées par l'AFSSA, ont révélé qu'elles appartiennent aux deux grands groupes (incluant plus de 80 génotypes) définis mondialement. De plus, quatre génotypes sont définis uniquement par des souches françaises. Deux d'entre eux, les génotypes GT79 et GT80, appartiennent au sous-groupe B2 et sont dominants en France, dans les régions montagneuses, mais rares dans le reste du monde. Ces observations sont en faveur de l'existence d'un rôle potentiel des facteurs environnementaux sur la sélection de certains génotypes. De plus, les glycoprotéines BclA de l'exosporium des souches du groupe B2 sont particulièrement intéressantes. En effet, à la différence des profils BclA observés pour les autres souches de B. anthracis, présentant une seule bande glycosylée, les souches du sous-groupe B2 ont un profil comportant plusieurs bandes BclA glycosylées. Des expériences d'échanges de gènes nous ont permis de montrer que la présence de plusieurs bandes BclA glycosylées est liée au fond génétique de ces souches. L'hypothèse est que, pour les souches concernées, certaines fonctions impliquées dans les modifications post-traductionnelles de BclA, comme la glycosylation, seraient affectées. La caractérisation des fonctions potentiellement impliquées dans ces modifications est en cours.

Mots-clés: Anthrax, surface, toxines, virulence, spores, vaccin



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  FERRAND Mireille, IP, (mmferran@pasteur.fr) FOUET Agnès, Directeur de recherche 2 CNRS

GOOSSENS Pierre, Chargé de recherche IP

MARY-POSSOT Odile, Chargé de Recherche IP

MOCK Michèle, Directeur de Recherche 1 CNRS, Chef de labo IP, Responsable de l'unité et du CNR Charbon

CANDELA Thomas, Doctorant UP7

DAVISON Sophie, Doctorante UP6

DO PHAN Viet, Chercheur contractuel

GLOMSKI Ian, Chercheur postdoctoral, boursier de la Pasteur Foundation

MOYA-NILGES Maryse, Chercheur contractuel

PIRIS GIMENEZ Alejandro, Vétérinaire, doctorant UP7

RETUREAU Emilie, Master UP6

CORRE Jean-Philippe, Technicien de laboratoire IP

COUTURE-TOSI Evelyne, Ingénieur de Recherche IP

HAUSTANT Georges, Technicien de laboratoire IP

SYLVESTRE Patricia, Ingénieur de Recherche IP, Adjointe au Responsable du CNR Charbon


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