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     Trafic membranaire et Pathogenèse


  Responsable : Zurzolo Chiara (zurzolo@pasteur.fr)


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Grâce à l'utilisant de techniques de pointe en microscopie et imagerie cellulaire (time laps, Fret) combinées à des techniques plus classiques de biochimie, notre laboratoire a deux objectifs majeurs :

comprendre les bases moléculaires du tri et de l'adressage apical des protéines GPI dans les cellules polarisées

caractériser l'endocytose et l'exocytose de la protéine prion normale et pathogène dans les cellules épithéliales et neuronales de façon à identifier le site intracellulaire de conversion.



  rapport

cale

La polarité est une des plus importantes propriétés des épithéliums et se manifeste par la formation de deux domaines membranaires distincts : le domaine apical et le domaine basolatéral, dont la composition en lipides et protéines diffèrent et leur assure des fonctions spécialisées. Les mécanismes responsables de la formation et du maintien de cette polarité n'ont été que partiellement caractérisés. La compréhension des mécanismes moléculaires à l'origine de la polarité cellulaire est par conséquent un objectif de première importance pour la biologie cellulaire des mammifères. Nous avons focalisé nos études sur les mécanismes d'adressage apical des protéines glypiées (protéines GP<I) et le rôle des microdomaines lipidiques (ou rafts) dans le tri des protéines et des lipides au niveau du " Trans Golgi Network " (TGN). Ce travail est réalisé dans deux modèles cellulaires, les cellules épithéliales MDCK et FRT, présentant des phénotypes d'adressage différents. Dans ces lignées cellulaires, nous étudions également les mécanismes d'exocytose et d'endocytose de la protéine prion normale, PrPc, et de ses mutants pathologiques, dans le but de comprendre le rôle du trafic intracellulaire et des rafts dans la fonction et la conversion de PrPc en sa forme infectieuse pathologique (PrPsc).

Deux projets principaux sont en cours de réalisation dans mon unité :

les mécanismes d'adressage polarisés des protéines GPI vers la membrane plasmique le trafic intracellulaire de la protéine PrPc et de ses mutants : corrélation avec les mécanismes de pathogénèse des encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST)

Etude des mécanismes d'adressage polarisés des protéines GPI vers la membrane plasmique

Les rafts sont des microdomaines lipidiques enrichis en glycosphingolipides (GSL) et en cholesterol qui ont été proposés comme plateforme impliquée dans le transport des protéines et des lipides vers la membrane apicale. Les protéines glypiées sont en effet adressées vers le pôle apical de plusieurs cellules polarisées et associées aux rafts (ou DRM pour Detergent-Resistant Microdomains) durant leur transport entre le TGN et la membrane plasmique. Cependant, les mécanismes moléculaires à l'origine de l'association des protéines glypiées aux rafts puis le rôle de cette association dans le transport vers la membrane apicale sont mal connus et plusieurs questions restent ouvertes : quel élément détermine l'association des protéines glypiées aux rafts ? Existe-t-il différents types de rafts pour différentes protéines glypiées ? Existe-t-il un récepteur responsable du tri des protéines vers différentes vésicules de transport à la sortie du TGN ?

Dans ce projet, nous utilisons des approches microscopiques et biochimiques pour analyser le rôle des rafts dans le tri et le trafic des protéines GPI.

Pour cela nous avons déjà obtenu des clones stables issus des cellules FRT et MDCK, exprimant différentes protéines chimériques fusionnées à la GFP et étudié le transport intracellulaire de ces protéines dans les cellules vivantes, en utilisant des techniques de microscopie et d'imagerie cellulaire. Nous avons montré que la GFPpossédant l'ancre GPI du récepteur au Folate (GFP-GPI) est exprimé au pôle basolatéral dans les cellules FRT et au pôle apical dans les cellules MDCK. En revanche, GFP-TM, une protéine de fusion contenant le domaine transmembranaire et cytosolique du récepteur LDL (Low Density Lipoprotein) est exprimé au pôle basolatéral dans les deux lignées cellulaires. Ces mêmes approches de microscopie et d'imagerie cellulaire dans les cellules vivantes ont été utilisées pour caractériser les cynétiques de trafic apical et basolatéral. Les protéines GFP-GPI et GFP-TM ont été bloquées au cours du processus d'exocytose dans le TGN par une incubation des cellules à 20°C. Après une ré-incubation à 37°C, nous avons pu suivre et mesurer les cynétiques d'adressage membranaires des deux protéines. Nous avons également pu mesurer la taille et la vitesse des vésicules assurant le transport de ces deux protéines entre le TGN et les membranes apicales et basolatérales dans les cellules FRT et MDCK. Ce travail, en cours de réalisation, a été effectué au CID de l'Institut Pasteur et en collaboration avec le Dr Fogarty à l'Université du Massachussets (USA).

Nous avons montré, avec d'autres laboratoires, que l'association des protéines aux rafts dépend de l'ancre GPI. Cependant, ceci n'est pas suffisant pour déterminer l'adressage apical des protéines. Nous pensons qu'un phénomène de concentration et stabilisation des protéines à l'intérieur de ces microdomaines intervient dans l'adressage apical des protéines GPI. En utilisant une approche biochimique, nous avons montré que seules les protéines GPI apicales (et pas les protéines GPI basolatérales) forment des oligomères de haut poids moléculaire. Au cours de cette année (Paladino et al, 2004) nous avons démontré que cette oligomérisation est responsable de la stabilité des protéines GPI dans les rafts. Nous projetons d'analyser ces oligomères par spectrométrie de masse afin d'identifier une éventuelle molécule de tri. Parallèlement, nous sommes en train d'étudier le mécanisme responsable de l'oligomérisation des protéines GPI-apicales.

De plus, afin d'analyser le rôle des ancres GPI et des ectodomaines dans le tri, nous avons transfecté différentes protéines GPI et protéines transmembranaires dans les cellules MDCK et FRT. Nous avons ensuite utilisé des techniques biochimiques de " cross-linking " et de co-immunoprécipitation. Des résultats préliminaires suggèrent que deux protéines GPI différentes sont retrouvées dans les mêmes complexes , alors que les protéines transmembranaires en sont exclues. Une approche parallèle, pour analyser la localisation des protéines GPI et transmembranaires entre le TGN et la membrane cellulaire, consiste à mesurer le transfert résonnant d'énergie de type Förster (FRET) entre deux protéines fluorescentes. Pour cela, nous utiliserons une technique de FRET classique (grâce à des protéines fusionnées au fluorophore CFP/YFP) ainsi que des mesures d'anisotropie (en utilisant la GFP). Nous avons préparé différentes constructions, dans lesquelles des signaux d'ancrage GPI (provenant de PLAP, DAF, FR and PrP) ont été fusionnés au fluorophore CFP/YFP/GFP. Nous avons transfecté quelques-unes de ces constructions dans les cellules MDCK et obtenu des clones stables que nous sommes en train d'analyser par FRET et/ou anisotropie. De plus, afin de déterminer s'il existe des différences importantes entre les ancres GPI à destination apicale ou basolatérale, nous avons purifié différentes protéines GPI exprimées au pôle apical ou basolatéral des cellules FRT et étudions la nature lipidique des ancres GPI en collaboration avec le laboratoire du Dr M. Ferguson à Dundee (USA).

Etude du trafic intracellulaire de la protéine PrPc et de ses mutants : corrélation avec les mécanismes de pathogénèse des encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST)

Les Encéphalopathies Spongiformes Transmissibles (EST), appelées aussi maladies à Prion, sont des maladies dégénératives du système nerveux central dont l'issue est fatale quelque soit leur origine (spontanée, infectieuse ou héréditaire). Ces maladies ne seraient pas causées par des agents conventionnels, mais par un variant de conformation (PrPSc ou Scrapie) de la protéine prion normale endogène PrPC, une protéine glypiée qui réside à la surface cellulaire. Il a été proposé que la structure en hélice αde la forme endogène normale PrPC soit trans-conformée en feuillet βau contact de la forme mal repliée PrPSc. PrPSc forme des agrégats hydrophobes et est hautement résistante aux protéases. Cette propriété permet de diagnostiquer les infections à prions mais elle est également la définition, au sens large, de l'événement infectieux à l'origine des troubles neuropathologiques des EST.

Bien qu'il soit établi que la conversion de la forme PrPC en PrPSc joue un rôle central dans la pathogenèse des EST, on ne sait toujours pas quand et où dans la cellule ce processus intervient. Nous sommes convaincus que la conversion de la PrPC normale en sa forme pathogène PrPSc est fortement influencée par le trafic intracellulaire de la protéine. Les cellules épithéliales sont très similaires aux cellules neuronales, mais leur trafic intracellulaire (endocytose et exocytose) est mieux caractérisé. Elles représentent donc un modèle idéal pour étudier le trafic intracellulaire de la protéine PrPC et de ses mutants. De plus, dans les cellules issues de neuroblastome, PrPC est associé aux microdomaines membranaires insolubles au TX 100 et une déplétion en cholestérol réduit la dégradation de PrPC et inhibe la formation de PrPSc. Nous avons montré qu'après extraction au TX 100 à 4°C, PrPC est majoritairement insoluble. Sachant que PrPC est adressé au pôle basolatéral des cellules FRT et MDCK, ce résultat indique qu'une association au DRM (Detergent Resistant Microdomains) n'est pas suffisante pour permettre un adressage apical des protéines GPI. Nous avons caractérisé l'association de PrPC au DRM par des expériences de radiomarquage en " pulse chase " et montré que des isoformes immatures de PrPC sont associés au DRM à un stade précoce de l'exocytose : dans le réticulum endoplasmique (RE). En déplétant les cellules de leur contenu en cholestérol, nous avons perturbé l'association de PrPC aux DRM, ce qui a entrainé un mauvais repliement de la protéine, suggérant qu'une association de PrPC aux DRM est nécessaire au repliement de la protéine prion (Sarnataro et al, 2004). Sachant que les TSE résultent d'un mauvais repliement de la protéine prion, ce résultat semble pertinent dans la compréhension des mécanismes à l'origine du mauvais repliement. Nous testons actuellement l'association au DRM et leur effet sur le repliement de différentes formes mutées de la protéine prion. En collaboration avec Tony Futerman à l'Institut Weizmann, nous analysons la composition en lipides des DRM associés aux formes normale et mutées de la protéine prion.

Nous analysons également l'exocytose d'un simple et d'un double mutant de glycosylation de PrP ainsi que d'un mutant sans ancre GPI. De façon intéressante, le mutant de glycosylation A182T, qui est pathologique (trouvé dans les formes familiales de CJD) présente d'importantes différences dans le tri et l'association au DRM par rapport à la protéine sauvage. Dans notre laboratoire de niveau P3 nous travaillons sur le trafic intracellulaire de la forme pathogène PrPSc, dans le but de pouvoir identifier le site de conversion de la protéine prion. Nous avons réalisé des protéines chimériques PrP normale et PrP mutées fusionnées à la GFP que nous projetons d'utiliser pour identifier le site de conversion dans les cellules vivantes.

Nous avons également progressé dans la compréhension des mécanismes d'endocytose de PrP. Il a été montré que PrPC peut être internalisé soit dans des vésicules à clathrine, soit dans des caveolae. Après l'endocytose, PrP est recyclé vers la surface cellulaire. L'étude de ce recyclage revêt un intérêt particulier car c'est probablement au cours de ce processus que se produit la conversion de PrP en PrPC. De plus, une des fonctions physiologiques de PrPC serait de faciliter l'internalisation d'un ligand extracellulaire non encore identifié. De façon analogue au récepteur responsable de l'internalisation de la transférine et des lipoprotéines de faible densité.

Afin de tester l'implication des caveolae et des " puits recouverts " dans le processus d'endocytose des différents isoformes de la protéine prion, nous avons utilisé des cellules FRT qui n'expriment pas la caveoline et ne possèdent pas de caveolae, ainsi que des cellules FRT transfectées avec cav1 et capables de former des caveolae. Nous avons montré que la protéine prion est internalisée dans les deux lignées cellulaires, mais jamais retrouvée à l'intérieur des " puits recouverts ". Ces résultats, ainsi que d'autres précédemment obtenus, nous laissent penser que la protéine prion est internalisée par un processus qui n'implique ni les " puits recouverts " ni les caveolae, mais qui serait dépendant des rafts. Nous étudions actuellement ce processus d'internalisation.

Mots-clés: trafic intracellulaire, rafts, tri des protéines, prion, site de conversion



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Goisnard, Christiane (cgoisnar@pasteur.fr) Zurzolo, Chiara, IP (Chef d’Unité Postulante, zurzolo@pasteur.fr) Borhan, Rosa, Master M2

Paladino, Simona, stagiaire post-doctorale

Catino, Maria-Agata, étudiante en thèse

Campana, Vincenza, étudiante en thèse

Fasano, Carlo, étudiant en thèse

Pocard, Thomas, étudiant en thèse

Schiff, Edwin, étudiant en thèse

Casanova, Philippe (Technicien, pcasanov@pasteur.fr)

Goisnard, Christiane (Secrétaire 30 %, cgoisnar@pasteur.fr)


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