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     Rétrovirus & Transfert Génétique - INSERM U622


  Responsable : Jean Michel Heard (jmheard@pasteur.fr)


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Thème 1 : Neurodégénérescence associée aux maladies de surcharge lysosomales. Etudes physiopathologiques (inflammation, transport axonal) et thérapeutiques (thérapie génique pour fournir l'enzyme manquante). Thème 2 : Cellules souches neurales. Reprogrammation génétique (expression forcée de facteurs de transcription). Thème 3 : études de l'implication du gène pro-apoptotique Barhl2 au cours du développement, de la tumorigénèse et des processus dégénératifs du système nerveux.



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Thème 1 : Neurodégénérescence associée aux maladies de surcharge lysosomale (F. Chen, A. Cressant, N. Desmaris, S. Vitry).

Les maladies de surcharge lysosomale sont des erreurs innées du métabolisme caractérisées par la fréquence des manifestations neurologiques, souvent gravissimes et précoces dans l'enfance. Leurs causes génétiques (en général une perte de fonction) sont bien décrites, ainsi que les conséquences sur les fonctions cataboliques du lysosome. Les mécanismes conduisant du désordre biochimique à la souffrance cellulaire et à la pathologie neurologique sont toutefois incompris et, à ce jour, non accessibles à un traitement. Nos études portent sur deux modèles de mucopolysaccharidoses responsables d'une accumulation d'héparane sulfates incorrectement dégradés et hypersulfatés. Nous essayons de comprendre les liens entre l'accumulation de ces composés, l'activation microgliale et astrocytaire, et la neurodégénérescence. Les études sont effectuées sur des modèles in vitro et chez la souris ou le chien malades. Elles portent sur les mécanismes d'induction d'une réponse inflammatoire et ses conséquences neurotoxiques et sur le transport axonal.

L'apport de l'enzyme lysosomale déficiente est un traitement possible de ces maladies. L'accès au système nerveux central nécessite toutefois de franchir ou de contourner la barrière hémato-encéphalique. Nous avons montré l'intérêt de la thérapie génique chez la souris et chez le chien. La création d'une source permanente d'enzyme dans le striatum est réalisable par l'injection de vecteur adéno-associés (AAV1, 2 ou 5). L'apport d'enzyme à l'ensemble du cerveau est faisable chez la souris par une injection unique de vecteur AAV5. Quatre injections suffisent chez le chien. Un réseau de collaboration a été mis en place comportant des neuropédiatres, des neurochirurgiens et des vétérinaires afin de compléter les études précliniques d'efficacité et de tolérance en cours chez le gros animal, et de définir les modalités d'un traitement chez l'enfant. Ce programme est soutenu par l'AFM, l'INSERM et l'Institut Pasteur.

Thème 2 : Cellules souches neurales (S. Blanchard, D. Bohl, T. Bréjot, S. Liu, A. Nosjean, M. Hocquemiller).

La survie, la multiplication, la différenciation et la migration des cellules souches neurales, ainsi que le développement des connections synaptiques, dépendent de signaux externes environnementaux et de la compétence génétique des cellules cibles à y répondre. Certains de ces déterminants ont été identifiés au cours d'études sur la mise en place des motoneurones spinaux chez l'embryon. Il s'agit en particulier de gradients de facteurs solubles, comme l'acide rétinoïque (RA) ou Sonic Hedgehog (Shh), dont la concentration détermine l'expression de facteurs de transcription à domaine homéotique ou bHLH.

Un objectif de ce programme consiste à examiner le devenir de cellules souches neurales isolées à partir de tissu fœtal, amplifiées sous forme de neurosphères et exposées à des facteurs solubles ou à des vecteurs lentiviraux induisant l'expression forcée de facteurs de transcription impliqués dans la génération des motoneurones (Pax6, Nkx6.1, Olig2, Ngn2, HB9, Islet1). L'expression de multiples marqueurs associés à la différenciation motoneuronale a été étudiée par PCR quantitative et immuno-marquage. Seule l'expression forcée du facteur bHLH Ngn2 modifie le devenir des cellules neurales in vitro, conduisant à une différenciation massive en cellules exprimant des marqueurs neuronaux aux dépend de la formation d'astrocytes ou d'oligodendrocytes. La caractérisation de ces cellules ainsi que l'étude de leur devenir après transplantation dans la moelle épinière ou dans l'hippocampe de rats adultes est en cours d'étude.

Des travaux similaires sont menés avec des cellules souches embryonnaires (ES) de souris. La sélection des cellules exprimant le facteur de transcription Sox1 au décours de la formation de corps embryonnaires permet d'isoler une population formant plus de 80% de cellules exprimant des marqueurs neuronaux. L'exposition de ces cellules à RA et Shh conduit à une différenciation motoneuronale in vitro. Ces cellules sont maintenant transplantées dans le noyau du nerf moteur facial chez la souris afin d'étudier leur capacité à former des motoneurones et des axones moteurs in vivo.

Thème 3 : études de l'implication du gène pro-apoptotique Barhl2 au cours du développement, de la tumorigénèse et des processus dégénératifs du système nerveux (B. Durand, N. Duval, N. Offner).

L'apoptose précoce touche les cellules en phase proliférative ou récemment différenciées et plus particulièrement les cellules du système nerveux central (SNC). Nous avons caractérisé une nouvelle fonction au cours de la morphogénèse du SNC pour un gène à homéoboîte très bien conservé chez les vertébrés : barhl2. L'induction d'une surexpression de Barhl2 chez le Xénope, et surtout l'inhibition de sa fonction à l'aide de morpholinos, ont montré que Barhl2 joue un rôle important dans la mise en place de la ligne médiane, un centre organisateur précoce de la plaque neurale, et à des stades plus tardifs dans la régionalisation de la plaque pro-encéphalique. L'analyse d'embryons de Xénope et celle de cellules de souris en culture ont permis de montrer que l'expression de Barhl2 s'accompagne d'une mort cellulaire programmée inhibée par Bcl2 et dépendante des caspases.

L'objectif du laboratoire est d'étudier la ou les fonctions du gène barhl2 et les modes de contrôle régulant son expression et son activité pro-apoptotique chez le Xénope et la souris. Nos observations suggèrent que le gène barhl2 se situe en amont de la cascade apoptotique et qu'il pourrait contrôler l'engagement des cellules vers une mort cellulaire programmée. Elles convergent aussi vers l'hypothèse d'une participation de Barhl2 à la signalisation en aval des récepteurs Patch et Smothen, dont l'activité est contrôlée par Shh. Des anomalies de la signalisation par Shh sont fréquentes dans différents cancers, dont les médulloblastomes. Elles peuvent rendre compte d'une prolifération cellulaire anormale. L'association d'une réponse mitogène anormale à une anomalie de la réponse apoptotique pourrait conduire à une prolifération maligne, comme précédemment décrit dans de nombreux processus tumoraux.

Les expériences en cours visent à élucider l'implication éventuelle de Barhl2 dans la voie de signalisation dépendante de Shh et examinent si un lien peut être établi entre la perte de la fonction de Barhl2 et la cancérogénèse. L'hypothèse d'un gain de fonction des gènes Barhl associé aux processus neurodégénératifs est également considérée.

Ce travail devrait nous donner accès à des informations importantes concernant l'intensité, la régulation et la fonction de l'apoptose très précoce, un aspect sous-estimé du développement cellulaire lors de la morphogénèse précoce du cerveau, ainsi que sur la dérégulation de ce processus liée à l'émergence de cancers et de maladies neurodégénératives.

Légende : La surexpression de barhl2 induit la mort cellulaire programmée des cellules du neuroectoderm. Un marquage TUNEL a été réalisé au stade 15 sur des embryons de Xénope injectés dans un blastomère dorsal au stade 4-cellules avec de l'ARN codant pour barhl2. Une augmentation du nombre de cellules TUNEL positives est observable du côté injecté de l'embryon.

Mots-clés: thérapie génique, neurodégénérescence, maladies lysosomales, cellules souches neurales, vecteurs viraux, développement du système nerveux, sonic hedgehog, Barh, gènes homéotiques



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Chantal Brulet, rtg-sec@pasteur.fr Delphine Bohl CR1 INSERM dbohl@pasteur.fr

Béatrice Durand CR1 CNRS bdurand@pasteur.fr

Jean Michel Heard DR1 INSERM jmheard@pasteur.fr

Song Liu CR1 INSERM songliu@pasteur.fr

Anne Nosjean CR1 CNRS nosjean@pasteur.fr

Nathalie Duval CR IP natoche@pasteur.fr

Arnaud Cressant Stage post-doctoral cressant@pasteur.fr

Nicolas Offner Stage post-doctoral offner@pasteur.fr

Sandrine Vitry Stage post-doctoral svitry@pasteur.fr

Thomas Bréjot Thèsard Paris VII tbrejot@pasteur.fr

Fengtian Chen Thèsard Paris VII ftchen@pasteur.fr

Michael Hocquemiller Etudiant M2 Paris VII michoc@pasteur.fr

Nathalie Desmaris Technicienne Supérieure 2D nchodan@pasteur.fr

Stéphane Blanchard Technicien Supérieur 2D sblancha@pasteur.fr


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