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     Régulation Enzymatique des Activités Cellulaires


  Responsable : Michel VERON (mveron@pasteur.fr)


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Les thématiques du laboratoire en 2004 ont été : (A) l'étude de la phosphorylation des analogues de nucléotides utilisés dans les thérapies anti-virales ; (B) l'étude des propriétés biochimiques et structurales de la protéine NEMO, élément régulateur essentiel de la voie de transduction NF-κ B et son altération chez les malades possédant un gène NEMO muté ; (C) l'étude du mécanisme de la recombinaison génétique chez les rétrovirus.



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Phosphorylation des analogues de nucléotides utilisés dans les thérapies anti-virales. (Sarah Gallois-Montbrun et Dominique Deville-Bonne)

Les analogues de nucléosides comme l'AZT qui figurent dans les protocoles thérapeutiques contre le SIDA et certaines maladies virales sont dispensés aux malades sous forme de nucléosides. Ils sont phosphorylés en dérivés triphosphate par des kinases cellulaires et deviennent des terminateurs de chaînes pour la transcriptase inverse virale. La Nucléoside Diphosphate (NDP) Kinase catalyse la dernière étape de cette voie d'activation. Depuis plusieurs années, nous étudions la réactivité de la NDP kinase humaine avec des analogues utilisés en thérapie (ddI, ddC, AZT, d4T). La phosphorylation des analogues qui sont dépourvus de groupe 3'OH sur le sucre est beaucoup moins efficace que pour les nucléotides naturels. La combinaison des études des complexes au niveau biochimique et structural (coll. J. Janin, LEBS, Gif-sur-Yvette) a permis de proposer un modèle pour le mécanisme de la phosphorylation de ces agents thérapeutiques par la NDP kinase (1).

La ribavirine, un analogue de guanosine utilisé contre les virus à ARN, est également active au niveau cellulaire sous forme triphosphate. Nous avons testé l'efficacité d'une série de dérivés modifiés sur le sucre afin de rechercher un analogue actif à plus faible dose dépourvu de cytotoxicité. Un dérivé dépourvu d'hydroxyle en 2' réagit bien avec la NDP kinase et la transcriptase de l'hépatite C. (coll. L. Mulard, Unité de Chimie Organique, IP et B. Canard, ESIL, CNRS Marseille) mais nous n'avons pas pu démontrer d'activité antivirale sur des cellules en culture infectées par différents virus à ARN (Coll. J. Balzarini, Rega Institut, Leuwen).

Nous avons modifié la NDP kinase humaine au niveau de son site actif pour qu'elle devienne un meilleur agent de conversion des pro-drogues nucléosidiques au sein des cellules infectées. In vitro l'enzyme mutant L55H-N115S montre un gain de spécificité de plus de 300 fois pour les analogues substitués en 3'0H du sucre. Des expériences sur des cultures cellulaires ayant pour but de déterminer si la présence de cette protéine mutante dans les cellules altère leur sensibilité aux analogues de nucléosides n'ont pas été positives (coll. J. Balzarini, Rega Institut, Leuwen).

Nous avons également étudié le rôle de plusieurs autres enzymes dans la phosphorylation des nucléotides de configuration L (2), et en particulier la PhosphoGlycerate Kinase (3) et l'UMP-CMP Kinase humaine dont la structure cristallographique est en cours de résolution (coll. P. Alzari, IP).

Etudes biochimiques de la protéine NEMO (NF-κ B Essential Modulator), un composant essentiel de la voie de signalisation NF-κ B. (Elisabeth FONTAN, François TRAINCARD, Jeanne CHIARAVALLI, Emilie vinolo et Fabrice Agou)

La plupart des cellules répondent à une grande variété de stimuli moléculaires dont les cytokines pro-inflammatoires (TNF-alpha et l'Il-1) et les endotoxines (LPS), en activant des gènes impliqués dans les réponses immunitaires et inflammatoires ou dans la tumorogénèse et l'apoptose. Ces gènes sont sous le contrôle des facteurs de transcription de la voie de signalisation NF-κ B. L'activation de cette voie est modulée par un complexe protéique de haut poids moléculaire comprenant les protéines kinases IKK et la protéine régulatrice non catalytique NEMO. Nous étudions les propriétés biochimiques et structurales de NEMO et le mécanisme moléculaire grâce auquel il induit l'activation des kinases IKK (coll. A. Israël, Unité de Biologie Moléculaire de l'Expression Génique, IP).

Nous avons démontré que NEMO (4) trimèrise par son domaine C-terminal qui contient plusieurs sous-domaines. Ces sous-domaines ont été purifiés et leurs propriétés d'association ont été caractérisées par filtration sur gel, polarisation de fluorescence, dichroïsme circulaire, centrifugation analytique et protéolyse ménagée. Nous avons montré que le domaine minimal de trimérisation de NEMO est composé du sous-domaine coiled-coil CC2-LZ et que les domaines CC2 et LZ s'associent l'un à l'autre pour former un hétéro-trimère stable. Sur la base d'un modèle structurel du repliement oligomérique de NEMO (4) nous avons conçu des peptides correspondant à des portions optimisées des sous-domaines CC2 ou LZ, mimant les zones de contact entre les sous-unités de NEMO et capables de pénétrer dans les cellules. Ces peptides ont été mis au contact de cellules pour bloquer la voie de signalisation NF-κ B en interférant avec l'oligomérisation de NEMO. Leur pénétration dans les cellules a été suivie par FACS et leur effet sur l'activation de la voie en réponse au LPS a été quantifié grâce à un gène ß-galactosidase rapporteur mis sous promoteur NF-κ B dans des lymphocytes pré-B 70Z/3 stablement transfectés. Nous avons montré que le peptide LZ et, à un degré moindre, le peptide CC2 bloquent l'activation de la voie NF-κ B par plusieurs signaux pro-inflammatoires (LPS, IL-1, TNF-alpha) avec des IC50 de l'ordre du µM (5). Des peptides contrôles tels que des peptides mutés et des peptides coiled-coil hétérologues sont sans effet. Nous avons aussi montré que nos peptides inhibent l'oligomérisation de NEMO in vitro et qu'ils interagissent avec la protéine in vivo. Ils sont spécifiques de la voie NF-κ B puisqu'ils sont sans effet sur les voies MAP Kinase/ERK et P38. Enfin, nous avons montré que les peptides CC2 et LZ induisent l'apoptose de cellules cancéreuses. Ensemble, ces résultats valident le concept d'une nouvelle stratégie d'inhibition de la voie NF-κ B dans les thérapies anti-inflammatoires et anti-cancéreuses via l'altération de l'oligomérisation de NEMO.

NEMO est aussi impliqué dans deux maladies génétiques humaines liées au chromosome X, la dysplasie ectodermique anhidrotique avec immunodéficience (EDA-ID) et l'Incontinentia pigmenti (IP). Certaines de ces mutations sont des mutations ponctuelles dans le gène codant pour la protéine NEMO. Nous avons commencé à étudier la mutation A288G identifiée chez un patient EDA-ID et localisée dans le motif CC2 de NEMO afin de rechercher d'éventuelles différences dans les propriétés biochimiques de la protéine muante (Coll. G. Courtois, Hopital St. Louis et JL. Cazanova, Hopital Necker).

Etude de la recombinaison génétique chez VIH. (Roman Galetto, Véronique Giacomoni, etienne SIMON-LORIERE et Matteo Negroni)

La recombinaison est une source majeure de variabilité génétique chez VIH. Il a été montré qu'entre 3 et 30 événements de recombinaison peuvent être introduits lors d'un cycle infectieux, selon le type cellulaire infecté. Chaque particule virale contient deux copies d'ARN génomique et la recombinaison est en grande majorité générée par un changement de matrices entre ces deux ARN (transfert de brin) lors de la transcription inverse. Nous avons développé deux systèmes expérimentaux originaux, basés sur l'utilisation de marqueurs génétiques, pour étudier les mécanismes de la recombinaison générée pendant la transcription inverse in vitro et, plus récemment, dans des cellules infectées (ex vivo). Nous avons montré que la structure de l'ARN génomique est un déterminant majeur dans le processus de recombinaison et notamment que les structures en épingle à cheveux constituent des " points chauds " de recombinaison dans les deux systèmes. In vitro, c'est la structure de l'ARN sur lequel la synthèse est transférée (ARN accepteur) qui constitue l'élément déterminant pour le processus. Nous avons aussi étudié le rôle de la nucléocapside (NC), la protéine virale la plus abondante du complexe de transcription inverse, qui augmente la fréquence de recombinaison in vitro grâce à son activité de chaperon d'ARN. Ces observations nous ont permis de formuler un modèle de la recombinaison dans des régions structurées de l'ARN génomique, dans lesquelles le transfert de brin est favorisé par un mécanisme ressemblant à la " migration de branche " qui a lieu pendant la recombinaison entre molécules d'ADN double brin (6). Dernièrement, nous avons montré que, dans les cellules infectées, l'existence d'un " point chaud " que nous avions étudié principalement, localisé dans le gène env, est due à la structure de l'ARN mais aussi à sa séquence. Les expériences en cours concernent l'étude par le système ex vivo de la recombinaison entre isolats appartenant à différents sous-types du groupe M du VIH-1, dans le but d'obtenir une carte de recombinaison le long du gène env en absence de toute pression de sélection. Cette étude fait partie d'un projet visant à caractériser les premières étapes dans la génération des souches recombinantes circulantes (CRF) réalisé pour partie en collaboration avec les laboratoires d'Eric Arts et de Jeff DeStefano, aux Etats–Unis.

Mots-clés: Thérapies anti-virales, Analogues de nucléotides, NDP kinase, Signal transduction, NF-kB, NEMO, Rétrovirus, HIV, Recombinaison



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Negroni Matteo, CR IP (matteo@pasteur.fr)

Veron Michel, DR1 CNRS (mveron@pasteur.fr)

Galetto Roman, Post-doc (rgaletto@pasteur.fr)

Vinolo Emilie, Thèse (vinolo@pasteur.fr)

Simon-Lorière Etienne, Thèse (etisl@pasteur.fr)

Gallois-Montbrun Sarah, Stagiaire (sarahgm@pasteur.fr)

Wyler Emanuel, Stagiaire (ewyler@pasteur.fr)

Chiaravalli Jeanne, Ing. Rech. IP CDD (jchiara@pasteur.fr)

Traincard François, Ing. Rech. IP (traincar@pasteur.fr)

Giacomoni Véronique, Techn. Sup. IP (verofern@pasteur.fr)

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