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     Production de Protéines recombinantes et d'anticorps (Plate-forme)


  Responsable : BÉGUIN Pierre (beguin@pasteur .fr)


  resume

 

La Plate-forme Production de Protéines Recombinantes et d'Anticorps a pour mission la production et la purification de protéines recombinantes ainsi que la production d'anticorps monoclonaux. Elle participe au programme de génomique structurale des Mycobactéries pathogènes et au Grand Programme Horizontal sur la tuberculose. Elle produit et caractérise des anticorps monoclonaux pour la recherche, le diagnostic et la thérapeutique



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La Plate-forme n° 5 comporte trois modules : a) Production d'anticorps monoclonaux (resp. Farida Nato, fnato@pasteur.fr); b) Production de protéines recombinantes (responsable Jacques Bellalou, bellalou@pasteur.fr); c) Purification de protéines et production de protéines dans le système baculovirus (resp. Stéphane Pêtres, spetres@pasteur.fr).

Anticorps Monoclonaux

Ce module est chargé de développer la production d'anticorps monoclonaux et leur caractérisation fine (détermination de constante d'affinité, " mapping " d'épitopes etc) en collaboration avec différentes unités de l'Institut. Les anticorps sont utilisés comme outils de recherche et de diagnostic ainsi que pour le développement de nouvelles thérapies.

Dans le domaine de la recherche, plusieurs projets concernent la détection d'antigènes présents à la surface des mérozoites de Plasmodium falciparum ou à la surface de globules rouges infectés par le parasite. Des anticorps monoclonaux contre ces antigènes serviront à tester in vitro leur pouvoir inhibiteur contre l'infection et à valider le choix des antigènes correspondants comme candidats vaccins. D'autres projets concernent la mise au point d'un dosage immunologique de la sialorphine, un inhibiteur peptidique de l'enképhalinase modulant la transmission des signaux nociceptifs, et la cartographie des épitopes exposés à la surface de la forme pathologique du prion.

Dans le domaine du diagnostic, le module s'est spécialisé dans la mise au point de tests immunochromatographiques sur bandelettes. Ces tests permettent l'identification dans les fluides biologiques d'antigènes spécifiques d'un pathogène. Ils sont très rapides, fiables et peuvent être exécutés dans les conditions les plus rustiques. Deux projets sont actuellement en cours: l'un vise à identifier les agents bactériens des méningites, en particulier les sérovars de Neisseria meningitidis; l'autre servira à diagnostiquer les agents responsables de diarrhées hémorrhagiques: Shigella dysenteriae, Escherichia coli entéropathogènes et Entamoeba histolytica.

Dans le domaine de la thérapie, le projet en cours consiste à obtenir des anticorps neutralisant les toxines du botulisme. L'immunothérapie est en effet le seul remède connu à l'heure actuelle contre cette pathologie.

Production de Protéines Recombinantes

Le module de Production de Protéines Recombinantes assure la production de cultures bactériennes en fermenteurs de 1 à 300 litres et la préparation d'extraits bruts des culots de cellules qui en dérivent. Il offre à la demande une activité d'expertise pour optimiser la production de protéines recombinantes. Il participe également à un programme de génomique structurale de Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium leprae ainsi qu'à un Grand Programme Horizontal sur la tuberculose. Notre rôle dans ce programme consiste à produire des protéines cibles pouvant servir au diagnostic, à la vaccination ou au criblage de nouveaux agents thérapeutiques.

L'objectif commun de ces activités est de produire chez Escherichia coli des quantités élevées de protéines recombinantes sous forme soluble et correctement repliée. Ces protéines, au besoin marquées à la sélénométhionine, sont utilisées afin de déterminer leur structure par cristallographie aux rayons X ou par RMN ou d'étudier leur fonction. Afin d'optimiser rapidement les paramètres de croissance et permettre une production à haut débit, nous utilisons une batterie constituée de 8 réacteurs miniaturisés, pilotés par un système informatique qui contrôle les principaux paramètres de chaque culture dans des conditions définies et totalement indépendantes. En fonction de l'évolution de la densité bactérienne mesurée en ligne, des séquences de température de croissance avant et après induction peuvent être programmées et réalisées automatiquement. Cette technologie est donc tout à fait adaptée à l'optimisation et à la production de protéines peu solubles. Grâce à l'utilisation de milieu Haute Densité, les rendements en biomasse totale et en protéine recombinante obtenus dans chaque réacteur de 70 ml sont similaires à ceux obtenus pour un litre de culture en fiole agitée. De plus, les conditions ainsi établies peuvent être directement transposées à des cultures en fermenteurs classiques de volume plus élevé.

La batterie de microfermenteurs est actuellement utilisé pour la majorité des cultures réalisées à la demande, ainsi que pour optimiser de nouveaux protocoles de culture, en particulier pour adapter au milieu Haute Densité la stratégie de milieux "autoinducteurs" mise au point par F.W. Studier. Cette approche consiste à remplacer l'isopropyl-β-thiogalactoside (IPTG) par le lactose comme inducteur et à réprimer l'expression du gène cible en début de croissance par l'ajout d'une quantité limitante de glucose. Lorsque le glucose est épuisé, le lactose peut pénétrer dans la cellule et être converti en inducteur allolactose par suite de l'élévation du niveau de lactose perméase et de β-galactosidase. Outre que la technique ne requiert pas d'intervention de l'opérateur pour ajouter l'inducteur, elle donne des résultats prometteurs dans le cas de certaines protéines difficiles à produire sous forme soluble.

Purification de Protéines et Production dans le Système Baculovirus

Le module Purification de Protéines et Production dans le Système Baculovirus a pour mission du purifier les protéines recombinantes présentes dans les culots bactériens obtenus par le module Production de protéines recombinantes. Cette tâche comprend le suivi des rendements et de la pureté des préparations. Outre les demandes de purification ponctuelles, il participe au programme de génomique structurale des Mycobactéries Pathogènes : les protéines purifiées sont transmises à la Plate-Forme Cristallogenèse et Diffraction des Rayons X pour les essais de cristallisation et l'analyse par diffraction des rayons X. Nous disposons d'un système de chromatographie programmable Äkta Explorer et de colonnes permettant de pratiquer divers types de séparation (IMAC, échange d'ions, tamisage moléculaire). A la demande, nous réalisons l'optimisation du processus de purification ainsi que des modifications post-traductionnelles in vitro (ablation du tag, protéolyse ménagée, renaturation). D'autre part, le module prend également en charge la production de protéines exprimées à partir de baculovirus recombinants dans des cellules d'insectes. Cette tâche comprend la construction du vecteur recombinant par co-transfection et recombinaison in vivo et la production de protéines à partir de cultures infectées. Des cultures stables de cellules transfectées peuvent également être obtenues. Nous recevons un nombre croissant de demandes pour la production de protéines dans ce système, particulièrement pour les protéines eucaryotes, qui sont synthétisées sous forme plus native que chez E. coli. Les projets reçus récemment concernent la production de protéases de Plasmodium vivax et de Plasmodium falciparum qui sont requises lors de l'infection des globules rouges par ces parasites, la production de glycosyl transférases pouvant servir à la synthèse de vaccins antitumoraux, et la synthèse de formes de la myosine spécifiques de l'oreille interne.

Photo: Batterie de fermenteurs en parallèle pour les cultures bactériennes à haut débit. A gauche, unité de réacteurs; à droite, unité de contrôle.

Mots-clés: Fermenteurs, protéines recombinantes, cultures automatisées, purification de protéines, baculovirus, anticorps monoclonaux, génomique structurale



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  ESNARD Muriel (mesnard@pasteur.fr) BÉGUIN Pierre, Institut Pasteur (Chef de Laboratoire, beguin@pasteur.fr) MAIMONI-GONCALVES Viviane, stagiaire post-doctorale, Institut Butantan, Brésil (vmaimoni@psteur.fr) BELLALOU Jacques, Ingénieur 3 Institut Pasteur, (bellalou@pasteur.fr)

BONDET Vincent, Ingénieur 2 Institut Pasteur, (vbondet@pasteur.fr)

DARTEVELLE Sylvie, Technicienne Supérieure 2D Institut Pasteur, (sdarteve@pasteur.fr)

FRACHON Emmanuel Ingénieur 2 Institut Pasteur, (efrachon@pasteur.fr)

IDJA Andrée, Aide de Laboratoire (aidja@pasteur.fr)

MARCHAND Françoise, Technicienne Supérieure de Laboratoire

MEIER Alain, (Ingénieur 2 Institut Pasteur, (ameier@pasteur.fr)

NATO Farida, Ingénieur 4 Institut Pasteur, (fnato@pasteur.fr)

PETRES Stéphane, Technicien Supérieur 2D Institut Pasteur, (spetres@pasteur.fr)


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