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     Synthèse d'oligonucléotides à haut débit (Plate-forme)


  Responsable : Gouyette Catherine (oligos@pasteur.fr)


  resume

 

Nous effectuons, dans notre plate-forme, exclusivement des synthèses d'oligonucléotides, mais de différents types :soit en plaques 96 (70mères), pour les puces à ADN et dans ce cas ce sont des oligonucléotides d'une longueur d'environ 70 bases ( purifiés sur colonnes rapides C18, vérifiés par HPLC analytique et électrophorèse capillaire), soit des synthèses effectuées " au coup par coup " d'oligonucléotides de longueur très variable, modifiés ou non, purifiés ou non par HPLC et en quantité allant de quelques unités de DO (à 260nm) à quelques milligrammes, soit des synthèses de siRNA purifiés



  rapport

cale

a) Tout d'abord, un bilan de ce qui a été fait cette année en format plaque 96 pour les projets retenus par le comité de pilotage de la Génopole :

- Nous avons terminé les 800 oligos qu'il restait à faire pour le projet Plasmodium falciparum, commencé en 2003, et également, les derniers oligos (série commencée en 2003) pour l'analyse de la virulence du parasite humain Entamoeba histolytica à l'aide de puces à ADN.

- Un gros ensemble d'oligonucléotides de 70 bases de long a été fait pour " la mise en place d'un outil pour l'étude du transcriptôme de la levure pathogène Candida glabrata " : 5910 oligos qui ont été aliquotés dans plusieurs lots identiques de 16 plaques 384 puits et envoyés dans différents laboratoires du consortium de Candida (UK, Irlande ,USA, Japon)

- Environ 500 oligonucléotides pour " étudier le profil d'expression des gènes de Bacillus anthracis en condition de culture mimant l'infection de l'hôte "

- Enfin dans le cadre de la " génomique fonctionnelle de Legionella pneumophila pour l'étude d'interactions hôte pathogène ", nous avons fait près de 4200 oligos, certains étant spécifiques des souches Columbia et Lens.

b) Comme les années précédentes,dans l'unité de Chimie Organique, avant la création de la plate-forme, nous faisions des oligonucléotides purifiés par HPLC, nous avons continué cette activité pour les besoins spécifiques de laboratoires avec lesquels nous avons toujours travaillé, tels que :

- Dr Oleg Melnyk, Institut Pasteur de Lille, en faisant des oligonucléotides fonctionnalisés par un groupement oxo-aldehyde en position 5' ou 3' permettant leur fixation , de façon covalente, sur des puces à ADN . Pour ce projet nous avons fait également des oligos substitués en 5' par un agent fluorophore (Cy5, Cy3) ou par un groupement C6-Amino.

- Pr Subirana, à l'Université de Barcelone, pour qui nous faisons régulièrement des oligos courts (de 6 à 14 bases) pour des études de cristallographie par rayons X. Généralement, nous faisons plusieurs milligrammes de chaque séquence, purifiée par HPLC et vérifiée par MALDI-TOF.

- Nous avons aussi commencé une nouvelle collaboration avec le Dr Frédéric Ariey à l'Institut Pasteur du Cambodge, pour qui nous avons fait des séquences marquées en 5' par Cy3 ou Cy5 dans le but de faire des puces à ADN pour diagnostiquer différentes souches de Plasmodium.

c) Nous travaillons aussi avec plusieurs laboratoires de l ‘Institut, en faisant des séquences d'ARN et surtout de ARNi (ARN interférent).

Le phénomène d'ARN interférence est un processus observé récemment dans lequel de petites molécules d'ARN double brin induisent une dégradation séquence-dépendante du simple brin homologue d'ARN messager.

Pour ce faire, nous avons obtenu des crédits de la DVPI conjointement avec le Laboratoire des Virus entérotropes et Stratégies anti-virales (sous la direction de Florence Colbère-garapin) qui nous ont permis de synthétiser de nombreux ARNi sur le sujet suivant : extinction par des ARNi de la multiplication de virus à ARN positif d'intérêt médical (entérovirus et virus de l'hépatite C).

d) Pour terminer, nous démarrons de nouveaux projets avec deux laboratoires :un à l ‘Institut Pasteur, l'unité de Biologie Cellulaire du Noyau, l'autre avec la Canceropole du Grand Est, centre de ressources biologiques, CHRU Nancy.

Dans ces projets nous avons déjà synthétisé quelques " molecular beacons " qui sont des séquences avec un fluorophore à une extrémité de la séquence (généralement en 5') et un " quencher " de fluorescence à l'autre extrémité (3').Quand ces séquences sont seules, elles adoptent une configuration dite en " épingle à cheveux " où les extrémités 5' et 3' sont proches et il n'y a pas d'émission de fluorescence. Quand la séquence est hybridée avec sa cible, les extrémités sont éloignées, le " quencher " ne joue plus son rôle et il y a émission de fluorescence

Mots-clés: oligonucléotides, siRNA, séquences d’ADN modifiées, molecular beacon



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  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Saint-Martin Françoise martinf@pasteur.fr     Huteau Valérie, Technicienne Supérieure vhuteau@pasteur.fr

Helynck Olivier, Technicien Supérieur ohelynck@pasteur.fr


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