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     Puces à ADN (Plate-forme)


  Responsable : Coppée Jean-Yves (jycoppee@pasteur.fr)


  resume

 

La plate-forme a pour vocation le développement des puces à ADN pour l'étude (génomique comparée et analyse des profils d'expression) des microorganismes modèles et des maladies infectieuses (microorganismes pathogènes et réponse de l'hôte à l'infection). Elle dispose de l'équipement nécessaire à la réalisation des puces sur divers supports ainsi que de plusieurs outils statistiques et bioinformatiques pour l'analyse, l'interprétation et la gestion des résultats.



  rapport

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La disponibilité des séquences complètes des génomes d'un nombre croissant de microorganismes et les potentialités des nouvelles technologies d'analyse de l'expression des gènes ont incité l'Institut Pasteur à mettre en place une plate-forme destinée à la fabrication et à l'analyse des "puces à ADN ". Celle-ci a pour vocation l'étude des microorganismes modèles et des maladies infectieuses. Dans ce dernier cas, nous nous intéressons aussi bien aux agents responsables de ces pathologies (génomique comparée et analyse du transcriptome) qu'à la réponse de l'hôte (analyse du transcriptome).

Actuellement, trois technologies sont utilisées à la plate-forme:

-Microarrays: dépôts de produits PCR ou d'oligos sur lames de verre et hybridation avec des cibles fluorescentes

- Macroarrays: dépôts de produits PCR sur membranes en nylon et hybridation avec des cibles radioactives

- Affymetrix: utilisation de puces commerciales contenant des oligos courts synthétisés in situ

La plate-forme réalise des projets suite à des appels d'offre interne. Ces projets sont réalisés sous forme de collaborations. La plupart des projets retenus ont un cadre national ou européen. Le coût de fabrication et de validation des puces est pris en charge (partiellement ou totalement) par la Genopole.

Pour ces projets, la plate-forme prend en charge:

- le dessin d'oligonucléotides (primers pour PCR et oligonucléotides longs pour spotting; la synthèse des oligonucléotides longs et leur contrôle qualité systématique sont pris en charge par PF7).

- les amplifications PCR (y compris quantification et contrôle qualité)

- les dépôts sur lames de verre, sur membranes en nylon

Elle assure également l'encadrement et la formation des utilisateurs pour:

- la préparation des cibles (fluorescentes et radioactives) et les hybridations

- la détection et quantification des signaux d'hybridation (formation aux logiciels GenePix et Arrayvision)

- l'analyse des résultats d'hybridation: plusieurs outils permettant la normalisation des données de puces ainsi que leur analyse statistique sont installés à la plate-forme. Nous utilisons essentiellement l'environnement R (Bioconductor) ainsi que plusieurs logiciels commerciaux (ArrayMiner, GeneSpring, S-Plus-ArrayAnalyzer...). L'analyse des données s'effectue systématiquement avec les utilisateurs.

- la gestion des résultats: en collaboration avec S. Moreira et I. Moszer (plate-forme Intégration et Analyse Génomique) une base de données a été développée selon les normes MIAME. Elle permet le stockage des données issues d'expériences de puces sur lames de verre et sur membranes en nylon.

La plate-forme met également à la disposition des utilisateurs du campus plusieurs outils permettant de vérifier la qualité des acides nucléiques (BioAnalyzer Agilent) et des cibles marquées (Nanodrop et Spectrophotomètre pour microplaques). Elle met également à disposition du campus un appareil de RT PCR (Applied Biosystems 7900) permettant la validation des résultats de puces à ADN.

Projets concernant les microorganismes pathogènes

En 2004, trois nouveaux projets d'analyse du transcriptome de microorganismes pathogènes ont été pris en charge par la plate-forme:

Etude du transcriptome du champignon pathogène Aspergillus fumigatus

A. Beauvais, I. Mouyna, J.P. Latgé (Unité des Aspergillus)

Profil d'expression des gènes de Bacillus anthracis en conditions mimant l'infection de l'hôte

O. Mary-Possot, M.Mock (Unité des Toxines et Pathogénie Bactérienne)

Génomique fonctionnelle de Legionella pneumophila pour l'étude d'interactions hôte-pathogène

C. Buchrieser (Uniité de Génomique des Microorganismes Pathogènes)

Par ailleurs, la plate-forme a poursuivi les études de transcriptome pour les projets sélectionnés lors des appels d'offres précédents. Ces projets concernent notamment les génomes complets de Candida glabrata (collaboration B. Dujon), Plasmodium falciparum (coll. P. David), Yersinia (coll. E. Carniel). Des puces dédiées contenant une partie du génome d'Entamoeba histolytica (coll. N. Guillen) ont également été réalisées. Ces projets ont notamment pour objectif l'analyse des modifications du transcriptome suite à diverses pressions environnementales ou immunes, la comparaison des transcriptomes de différentes espèces au sein d'un même genre, l'identification de facteurs de virulence, l'identification de cibles de régulateurs...

En 2004, nous avons mis en place une plate-forme dédiée plus spécifiquement à des projets de génomique comparée. Celle-ci développe, d'une part, des puces pour le typage et l'identification des microorganismes et, d'autre part, des puces appliquées à l'étude de la biodiversité et à la Santé Publique. Cette plate-forme est accessible à l'ensemble des Centres de Référence (qu'ils soient pasteuriens ou non) via un appel d'offres ouvert toute l'année (sélection des projets par un comité de pliotage). Deux projets ont été pris en charge par cette plate-forme en 2004: l'un vise au typage génomique de Legionella pneumophila (coll. C. Buchrieser) et l'autre à l'identification moléculaire des espèces du genre Bordetella (coll. N. Guiso). La Génopole a pris en charge les coûts de fabrication et d'utilisation des puces pour ces deux projets.

Projets concernant les eucaryotes supérieurs (mammifères)

La Génopole a fait l'acquisition en Janvier 2003 d'une station Affymetrix (comprenant une station de lavage, un four à hybridation et un scanner ainsi que les logiciels d'analyse et d'exploitation des données) afin de pouvoir étudier les profils d'expression chez les eucaryotes supérieurs et plus particulièrement dans le cadre de questions biologiques liées au développement ou à la réponse de l'hôte à l'infection. Dans le cadre de ces projets, nous prenons en charge le contrôle qualité des ARN, la préparation des ARN complémentaires et leur contrôle qualité, l'hybridation et l'analyse des images et des résultats. Cette dernière étape s'effectue avec les biologistes. Les projets pris en charge sont sélectionnés par appel d'offres (ouvert toute l'année). Chaque projet retenu est financé à hauteur de 2/3 par l'Institut Pasteur et 1/3 par le laboratoire demandeur sur des fonds propres.

En 2004, 8 projets ont été pris en charge par la plate-forme:

Réponse de cellules humaines modèles à une toxine mycobactérienne : la mycolactone

C. Demangel, E.Coutanceau, L. Marsollier et S.T. Cole (Unité de Génétique Moléculaire Bactérienne)

Analyse du transcriptome de xénogreffes lors de l'infection par Shigella flexneri .

T. Pédron, C. Parsot et P. Sansonetti (Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire, Inserm U389)

Identification de gènes impliqués dans la morphogenèse des bulbes olfactifs et dans les migrations cellulaires

N. Soussi-Yanicostas (Unité de Génétique des Déficits Sensoriels)

Détermination du transcriptome des cellules myosatellites au repos et après activation

M. Buckingham (Laboratoire Génétique Moléculaire du Développement)

Identification des cibles de Pax3

M. Buckingham (Laboratoire Génétique Moléculaire du Développement)

Analyse du transcriptome de primo-cultures de cellules astrocytaires et microgliales après interaction avec des lymphocytes T CD8 isolés de cerveau de souris développant un neuropaludisme

S. Pied (Unitè d'Immunophysiopathologie Infectieuse)

Étude in vivo du transcriptome de l'appareil respiratoire murin lors de l'infection par les pathogènes pulmonaires Klebsiella pneumoniae et Streptococcus pneumoniae (seconde partie).

R. Tournebize, T. Pédron, et P. Sansonetti (Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire, Inserm U389)

Étude des modifications transcriptionnelles en cas de méningo-encéphalites rabiques chez l'homme et chez le chien par puces à ADN.

H.Bourhy (Laboratoire de la Rage)

Mots-clés: Transcriptome, génomique comparée, maladies infectieuses, macroarrays, microarrays, Affymetrix



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Luchier Françoise, martinf@pasteur.fr   Bischoff Emmanuel, stagiaire post-doctoral, bischoff@pasteur.fr

Tien, Meng-Tsung, étudiant en thèse, tien@pasteur.fr

Coppée Jean-Yves,Ingénieur, jycoppee@pasteur.fr

Dillies Marie-Agnès, Cadre administratif et technique, mdillies@pasteur.fr

Jacquelin Béatrice, Ingénieur, beajac@pasteur.fr

Guigon Ghislaine, Cadre administratif et technique, gguigon@pasteur.fr

Lacroix Céline, Technicienne Supérieure de Laboratoire, clacroix@pasteur.fr

Régnault Béatrice, Ingénieur de Recherche, regnault@pasteur.fr

Schiavo Angèle, Technicienne de Laboratoire, angsch@pasteur.fr

Sismeiro Odile, Technicienne Supérieure de Laboratoire, osisme@pasteur.fr


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