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     Plasticité du génome bactérien


  Responsable : MAZEL Didier (mazel@pasteur.fr)


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Nous nous intéressons à la variabilité dans l'organisation des génomes bactérien, en particulier aux mécanismes d'acquisitions d'ADN d'origine exogène-les transferts latéraux de gènes. Nous nous intéressons en particulier au système de génie génétique naturel que constituent les intégrons, et qui joue un rôle majeur dans le développement et la dissémination des résistances multiples aux antibiotiques. De façon plus générale, nous nous intéressons à la structure des génomes des bactéries du genre Vibrio, qui ont pour caractéristique commune d'être constitués de deux chromosomes circulaires.



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A- Les intégrons.

Les transferts horizontaux de gènes jouent un rôle essentiel pour l'évolution des bactéries. Ces phénomènes jouent un rôle incontestable dans la propagation des déterminants de virulence et de pathogénicité, mais c'est toutefois dans l'émergence et le développement des multi-résistances au cours de la dernière moitié de ce siècle, que l'on trouve l'illustration la plus frappante, et peut-être la plus préoccupante, de l'importance de ces échanges génétiques. Dans ce phénomène global, la contribution d'une classe particulière d'élément mobiles, les intégrons, a été primordiale pour l'acquisition et la dissémination des gènes de résistance aux antibiotiques chez les bactéries à Gram négatif. C'est l'étude de ces mécanismes de transfert génétique, plus particulièrement ceux qui impliquent les intégrons, que nous poursuivons afin de mieux comprendre la dynamique et la mécanique de ces échanges génétiques, et leur rôle général dans la plasticité et l'évolution des génomes bactériens.

La structure de base des intégrons est invariablement composée d'un gène spécifiant une recombinase spécifique de site du type intégrase λ et d'un site de recombinaison, attI, situé en amont de celui-ci. L'activité de l'intégrase permet l'insertion ou le remplacement de cassettes portant un gène de résistance, au niveau du site attI, aboutissant à l'assemblage de loci multi-géniques pouvant héberger jusqu'à huit cassettes consécutives. À ce jour plus de soixante-dix cassettes de résistance différentes ont été décrites et toutes partagent la même structure modulaire: elles sont toujours composées d'un seul gène et se terminent par une séquence indispensable à la reconnaissance par l'intégrase et à la recombinaison avec le site attI, appelé site attC ou élément 59-base.

Bien que leurs propriétés catalytiques soient apparemment très similaires, 5 " classes " d'intégrons multi-resistants (MRI), définies par la séquence de leur intégrase, ont été décrites à ce jour, toutes véhiculées par des éléments d'ADN mobiles (transposons, plasmides).

Nous avons découvert l'existence d'un autre type d'intégron, les super-intégrons (SI), dans un grand nombre d'espèces des γ-proteobactéries. Ces intégrons possède des caractéristiques communes avec les intégrons multi-résistants, mais ils en diffèrent en 3 points : i) leur taille (plusieurs dizaines de cassettes); ii) la grande homogéneité des sites attC des cassettes qu'il contient ; iii) et par le fait que les fonctions codées par ses cassettes ne sont pas liées à la résistance aux antibiotiques. Nos analyses montrent que ce système est très ancien et que la plate-forme fonctionnelle de ces SIs est sédentaire et qu'elle co-évolue avec les génomes bactériens qui les hébergent. Ces données laissent supposer que les intégrons ont été détournés de leur fonction originelle, encore mal définie, par le développement d'une nouvelle pression de sélection, l'utilisation des antibiotiques par l'homme.

Nous avons proposé un modèle selon lequel l'utilisation des antibiotiques a conduit à la sélection d'intégrons portés par des structures aptes à les disséminer, transposons ou plasmides, à travers la capture d'un gène d'intégrase d'un SI et de son site attI. Sous la contrainte de cette nouvelle pression de sélection, ces intégrons mobiles auraient été capables d'intégrer et propager les cassettes de résistance à partir des réservoirs de cassettes des SIs sédentaires aux fonctions moins spécialisées.

Au cours de cette année, nous avons concentré notre activité sur trois objectifs:

I) Définir les caractéristiques structurales des super-intégrons des Vibrio, en particulier l'établissement de l'inventaire des systèmes poison-antidote présents dans les cassettes.

La comparaison des différents SIs de Vibrio que nous avons réalisé nous a permis de découvrir que tous les SIs hébergeaient plusieurs cassettes exprimant l'un ou l'autre des différents systèmes de mort cellulaire post-segregationelle (PSK, post-segregatinal killing, aussi appelés modules d'addiction) découverts dans les plasmides et qui assurent leur maintient dans les cellules filles. Ces cassettes pourraient être une des composantes clefs de la stabilité des rangées de cassettes des SIs. On peut imaginer que les cassettes PSK, qui ne peuvent être perdues sans entraîner la mort des cellules filles, compte tenu de leur dispersion tout au long du SI permettent de contre-sélectionner les délétions qui pourraient se produire entre cassettes répétées.

Nous avons maintenant démontré la fonctionnalité de plusieurs de ces PSK portés par des cassettes (ccdAB de V. fischeri, phd-doc de V. metschnikovii et V. cholerae, ), chez E. coli mais aussi dans leur contexte naturel (V. cholerae et V. fischeri) et montré que ces cassettes portaient un promoteur fort assurant leur expression (ceci a été réalisé en partie en collaboration avec le groupe de L. van Melderen, à l'ULB en Belgique, spécialiste du système ccdAB).

II) Achèvement des nouveaux outils génétiques pour manipuler les génomes de Vibrio afin de caractériser les phénotypes associés au SI chez V. cholerae.

Dans le cadre de nos différents projets, nous avons consacré une partie de nos efforts à la construction et au développement de nouveaux outils pour manipuler les génomes des Vibrio. Ces travaux ont conduit à la publication de deux articles (un article publié en 2004 et un sous presse).

III) Etude de la dynamique du processus de recombinaison des cassettes dans les super-intégrons, et des partenaires de ces réactions, sites de recombinaison et intégrases

Nous avons poursuivi l'étude de la dynamique de recombinaison dans ces structures chez V. cholerae, ainsi que l'étude comparative des paramètres de l'activité, en particulier la spécificité, des intégrases d'intégrons et de super-intégrons.

Par rapport au degré de compréhension acquis sur d'autres systèmes de recombinaisons, les connaissances de la mécanique d'échange des cassettes catalysée par l'intégrase dans les intégrons multi-résistants restent encore très superficielles. On ne connaissait ni les propriétés de recombinaison des intégrases des SI, ni la nature du processus d'assemblage des cassettes. Il nous a semblé très important d'établir si les intégrases des SI ont les mêmes caractéristiques de recombinaison que celles des intégrons multi-résistants. On peut se demander en particulier si, bien que les SI ne contiennent que des cassettes ayant des sites de recombinaison hautement similaires, les intégrases des SI sont capables de recombiner des cassettes portants des sites attC très différents et si leur activité ne nécessite pas de protéine accessoires.

Nous avons abordé ces questions par une étude comparative des activités de IntI1 (intégrase des MRI de classe 1) et de VchIntIA (intégrase de V. cholerae) dont les résultats sont présentés dans un article sous presse dans le Journal of Bacteriology.

B - Séquençage du génome de Vibrio lentus.

Le second projet développé dans l'unité à trait à l'identification des forces gouvernant la structure et la plasticité des génomes chez les Vibrio. Le genre Vibrio regroupe un grand nombre d'espèces pathogènes pour des hôtes allant de l'homme à un grand nombre d'espèces animales aquatiques. Les quelques espèces caractérisées jusqu'à maintenant ont pour propriété de posséder un génome fractionné en deux chromosomes, et l'analyse évolutive suggère que cette partition en deux molécules est ancienne. Toutefois, la comparaison des chromosomes d'espèces apparentées telles que cholerae et parahaemolyticus montre une grande variabilité dans l'organisation et le contenu de ces chromosomes. L'avantage sélectif conféré par cette organisation est inconnu et cela pose un certain nombre de nouvelles questions fondamentales en ce qui concerne, par exemple, leur ségrégation concertée. Cette partition offre aussi une opportunité unique de manipuler expérimentalement les chromosomes et de mieux comprendre les règles gouvernant leur structuration.

Pour mieux comprendre ces règles nous avons entrepris dans un premier temps le séquençage complet du génome d'une espèce éloignée de celles déjà séquencée (V. cholerae, parahaemolyticus, vulnificus), V. lentus souche MEL32 en collaboration avec la PF1 de la génopole de l'Institut Pasteur. Cette bactérie, isolée par l'IFREMER, est responsable d'épisode de mortalité estivale dans les nassains d'huîtres. La radiation phylogénétique des Vibrio comporte deux grandes branches, l'une contient les espèces déjà séquencées et qui sont des pathogènes pour l'homme, alors que l'autre regroupe tous les Vibrio pathogènes ou symbiontes d'animaux aquatiques, dont V. lentus. Il set donc clair que l'analyse comparative que nous allons menée permettra non seulement très certainement d'identifier les bases moléculaires de la pathogénicité de cette espèce pour l'huître, mais aussi d'affiner les règles d'organisation et de partition des génomes des Vibrio.

La taille du génome de Vibrio lentus souche Mel 32 est estimée à environ 5 megabases.

Jusqu'à maintenant, environ 60 000 séquences à partir de la banque d'ADN génomique de petits inserts, ainsi que 1600 séquences à partir de la banque de BACs, ont été réalisés. Ces séquences ont pu être assemblées en une vingtaine de contigs et nous sommes maintenant dans la phase de finition de ce projet de séquençage.

La comparaison par paire de génomes, de l'ensemble des séquences protéiques des quatre vibrions entièrement séquencés ainsi que celui de MEL32 a été entreprise et l'analyse détaillée de la structure et de la dynamique des deux chromosomes ainsi que l'identification in silico d'éventuels îlots de pathogénicité sont en cours de réalisation.

Mots-clés: intégron, site-spécifique recombinaison, transferts horizontaux, évolution, Vibrio



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Labouise Odile (labouise@pasteur.fr) Guérout, Anne-Marie, CR1 CNRS, guerout@pasteur.fr

Leroux, Frédérique, CR Ifremer, fleroux@pasteur.fr

Gaëlle DEMARRE (3ème année thèse, MRT fellow)

Marie BOUVIER (1ère année thèse, MRT fellow)

Mohamed ZOUINE, post doc IFREMER

Guillaume CAMBRAY, INA PG et master 2 génétique

Ducos-Galand, Magaly, Technicien, mducos@pasteur.fr

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