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     Membranes Bactériennes


  Responsable : WANDERSMAN Cécile (cwander@pasteur.fr)


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L'unité des Membranes Bactériennes étudie les transports membranaires chez les bactéries à Gram négatif en développant quatre thématiques de recherche: l'acquisition de l'hème dépendante d'hémophore, la sécrétion de protéines dépourvues de peptide signal par les transporteurs ABC, la caractérisation de protéines ABC de fonction inconnue et un système à deux composants impliqué dans l'acquisition du fer.



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1) Systèmes d'acquisition de l'hème dépendant d'hémophores (Sylvie Létoffé, Laurent Debarbieux, Philippe Delepelaire, Francis Biville, Frédéric Huché, Helène Cwerman, Najla Benevides Matos).

Les systèmes d'acquisition de l'hème source majeure de fer sont classés en deux groupes chez les bactéries à Gram négatif: ceux qui font intervenir des récepteurs de membrane externe reconnaissant directement l'hème et/ou les hémoprotéines et ceux qui dépendent d'une famille de petites protéines extra cellulaires appelées hémophores qui fixent l'hème libre ou lié à des hémoprotéines avec une très grande affinité puis le retournent à des récepteurs spécifiques. Le système Has de Serratia marcescens est codé par un opéron régulé par la carence en fer (Fig. 1). Il comprend HasR, le récepteur de l'hémophore, HasA, l'hémophore, HasD et HasE composants du transporteur ABC de l'hémophore et HasB, un homologue de TonB. HasR appartient à une famille de récepteurs de la membrane externe dont plusieurs membres déjà cristallisés possèdent une structure conservée avec un tonneau de feuillets bêta fermé du côté périplasmique par le domaine N-terminal appelé bouchon. Celui-ci interagit le complexe TonB-ExbB-exbD fournissant l'énergie dérivée de la force proton motrice pour le transport actif.

Les études structurales (en collaboration avec le groupe de RMN de l'Institut Pasteur) et génétiques de l'hémophore HasA de S. marcescens menées ces dernières années nous ont permis d'identifier les résidus ligands de l'hème, de préciser leur rôle respectif, de comparer les structures de l'holo et de l'apo-hémophore, de mesurer les affinités de l'apo et holo-hémophore pour le récepteur et d'identifier leurs sites d'interaction avec le récepteur. HasA interagit avec HasR par deux domaines de liaison, chacun situé sur un feuillet bêta de la protéine. Le peptide synthétique correspondant à un domaine de liaison (peptide 51-60) entre en compétition avec le domaine correspondant de l'hémophore pour la fixation sur le récepteur. Ceci indique que les deux domaines d'interaction sont indépendants. Nous faisons l'hypothèse que la fixation de l'hémophore par ses deux sites de liaison déforme la protéine de telle façon qu'elle transfère son hème au récepteur (Fig. 2).

Le récepteur HasR permet aussi l'utilisation de l'hème libre. Mais il fixe l'hème avec une affinité bien plus faible que HasA, de l'ordre du micromolaire. Ainsi, au cours du processus d'acquisition de l'hème, il se produit un transfert de l'hème d'une protéine de très haute affinité (HasA) à une protéine d'affinité plus faible (HasR). Le récepteur HasR mutagénisé sur les deux histidines qui sont conservées sur les récepteurs à hème ne permet plus l'acquisition de l'hème libre ou lié à l'hémophore. Au cours de cette année, les protéines sauvage et mutante ont été purifiées en présence de détergent sous une forme active et des études spectrophotométriques de ces protéines seules ou en complexe avec HasA montrent que le transfert d'hème de l'hémophore au récepteur se produit " in vitro " sans apport d'énergie.

Nous tentons de cristalliser le complexe hémophore-récepteur en collaboration avec le laboratoire de W. Welte à Constance ce qui nous permettra d'identifier en particulier les résidus ligands du fer dans le complexe.

Après transfert de l'hème à HasR, l'apo-hémophore reste à la surface cellulaire. Comme l'apo- et l'holo-hémophores ont la même affinité pour le récepteur, on se demande comment se fait l'échange entre hémophores vides et chargés sur le récepteur. Nous avons montré cette année que le recyclage des hémophores est une étape dépendante de l'énergie.

Certains récepteurs de la membrane externe, dont HasR, sont soumis à une autorégulation initiée par la fixation du ligand sur son récepteur. Cette fixation sans internalisation du substrat module l'activité de facteurs sigma et anti-sigma spécifiques et permet l'activation de la transcription. Dans le cas de HasR, le seul ligand inducteur est l'holo-hémophore. Le facteur sigma HasI et son anti-sigma HasS spécifiques sont codés par des gènes qui jouxtent l'opéron has (Fig. 1).

A l'aide d'une collection de mutants de HasA et de HasR, nous venons de montrer que le transfert de l'hème de l'hémophore au récepteur est nécessaire à l'induction et que seul l'un des deux domaines de liaison de HasA à son récepteur, le peptide 51-60 est requis pour cette induction. En utilisant des mutants de HasA incapables de fixer l'hème et mutés aussi dans l'un ou l'autre des peptides de liaison (51-60 ou 96-103), nous observons que les 2 composants du stimulus inducteur (l'hème et le peptide de liaison au récepteur 51-60) peuvent être apportés sur des molécules distinctes: nous testons actuellement l'induction par le peptide synthétique 51-60 en présence d'hème.

HasI est régulé par le répresseur Fur chargé de fer et n'est pas autorégulé. Le gène hasS par contre est régulé par HasI et est par conséquent soumis à la même cascade d'induction déclenchée par la fixation de l'holo-hémophore sur son récepteur. Ceci pourrait permettre l'accumulation de HasS sous une forme inactive qui devient active dès que HasR n'est plus occupé par holo-HasA et arrête ainsi instantanément la transcription de l'opéron.

La protéine HasR a été soumise à un découpage moléculaire en domaines en utilisant la modélisation par homologie du récepteur HasR (Fig. 3). Le résultat le plus spectaculaire de cette étude est que le tonneau bêta exprimé seul forme un pore de diffusion spécifique pour l'hème. Nous cherchons actuellement si de tels pores spécifiques à hème existent chez des espèces bactériennes vivant dans un environnement naturellement riche en hème.

Chez S. marcescens les gènes hasB et tonB ont des fonctions redondantes seulement pour l'acquisition de l'hème. La protéine mutante HasB6 fonctionnelle chez E. coli peut remplacer TonB uniquement pour l'acquisition de l'hème en présence de HasR. S. marcescens a au moins deux systèmes d'acquisition de l'hème: le système Has qui marche à très faible concentration en hème (25nM) et un second système qui requiert de plus fortes concentrations. Les analyses de séquence de S. marcescens DB11 faites au Sanger Institute (Cambridge, UK) montrent la présence d'un gène homologue à hemR, codant pour un récepteur présent chez de nombreuses bactéries à Gram-négatif et permettant l'acquisition de l'hème d'une façon indépendante des hémophores.

Les gènes hemPRS de S. marcescens ont été clonés cette année et introduits dans une souche auxotrophe pour l'hème (hemA) d'E.coli. Ils permettent l'acquisition de l'hème. Nous testons actuellement s'ils sont fonctionnels avec TonB, HasB6 ou les deux. Ceci nous permettra de comprendre les bases moléculaires de la spécificité de HasB.

2) La sécrétion des protéines par les transporters ABC (Sandra Cescau, Laurent Debarbieux, Annick Paquelin et Philippe Delepelaire)

La voie ABC (pour ATP Binding Cassette) ou voie de type I est l'une des quatre voies majeures de sécrétion des protéines actuellement connues chez les bactéries à Gram négatif. Comme la voie III, la voie I ne fait intervenir ni peptide signal N-terminal ni appareil de sécrétion Sec. Elle est donc indépendante du plus universel mécanisme de translocation des polypeptides.

Cette voie est caractérisée par la présence, dans le transporteur, d'une ATPase membranaire appelée protéine ABC. Ces protéines sont impliquées dans de très nombreux transports membranaires dont certains sont essentiels à la vie cellulaire. Le transporteur comprend deux autres protéines de l'enveloppe bactérienne.

Notre équipe a mis en évidence que cette voie permet la sécrétion de protéines de fonction et d'origine très diverses ayant toutes un signal C-terminal. Puis nous avons établi que les transporteurs comprennent une protéine de la membrane externe appartenant à la famille TolC, une protéine multifonctionnelle nécessaire à l'efflux des drogues et des sels biliaires (Fig.1).

Le signal de sécrétion C-terminal reste exposé sur la protéine grâce à des chaperons cytoplasmiques nécessaires à la sécrétion. Ce signal reconnaît la protéine ABC, module l'hydrolyse de l'ATP et induit la formation d'un complexe multiprotéique.

Nous venons de montrer qu'une protéine HasA délétée de son signal C-terminal interagit encore avec la protéine ABC. Nous testons actuellement si cette interaction produit la formation du complexe multi-protéique. Nous tentons de localiser ce nouveau site d'interaction avec la protéine ABC.

Nos futures recherches s'orientent d'une part vers le rôle des chaperons et l'état conformationnel des exoprotéines compatible avec la sécrétion, d'autre part vers la structure et la dynamique d'association du transporteur en un complexe multiprotéique. Nous cherchons à localiser sur HasA le site d'interaction avec le chaperon SecB et avons déjà délimité la zone d'interaction.

Le complexe pluriprotéique associant les protéines du transporteur et un substrat bloqué dans le transporteur a été purifié et est en cours d'analyse en microscopie électronique par F. Betancourt dans le laboratoire de R. Glaeser (Lawrence Berkeley National Laboratory). Parallèlement à cette collaboration nous avons entrepris la réassociation du complexe à partir de ses composants purifiés. La protéine ABC, qui interagit avec l'ATP, le signal de sécrétion et la protéine MFP est mutagénisée par insertion de pentapeptide pour obtenir des indications sur ses sites d'interaction potentiels. Les interactions seront aussi mesurées par ITC et Biacore.

3) Système à deux composants impliqué dans le contrôle de l'acquisition du fer (Francis Biville)

Ce système est présent chez de nombreuses bactéries. YgiY présente des homologies de séquence avec les kinases, senseurs membranaires des systèmes à 2 composants et YgiX avec les activateurs transcriptionnels phosphorylables. Chez E. coli, ce système est impliqué dans la régulation de nombreuses fonctions telles que la motilité, la formation de biofilms et l'acquisition du fer. Nous avons montré que l'inactivation de YgiY permet l'utilisation du fer complexé au pyrophosphate en l'absence d'enterobactine qui extrait le fer lié au pyrophosphate. Ceci suggère que YgiY/ YgiX régule un système d'acquisition du fer non encore identifié. YgiY possède un motif EXXE présent sur plusieurs protéines fixant le fer. Nous testons actuellement si YgiY peut fixer du fer radioactif. Nous essayons également de caractériser le chélateur de fer potentiellement produit par le mutant ygiY.

4) Analyse fonctionnelle et phylogénétique des systèmes ABC (Dorothée Murat, Laurent Goncalves et Elie Dassa)

Des protéines ABC dépourvues de domaines transmembranaires sont impliquées dans la régulation de l'expression génétique chez les eucaryotes. La fonction de leurs homologues bactériens est inconnue. Nous étudions 2 ORFs de cette famille chez E. coli, uup, et yheS.

Les mutants ne présentent pas de modification de phénotype dans les conditions habituelles de croissance en laboratoire. Cependant, co-cultivés avec la souche parentale (rapport 1 :1), les mutants sont défavorisés en phase stationnaire et disparaissent en 4-5 jours. Les effets des mutations sont additifs, le double mutant étant éliminé après 48 heures de culture. Le phénomène ne se manifeste pas quand les bactéries sont séparées par une membrane poreuse (0,2 μm). Ce résultat suggère qu'un contact physique est nécessaire à la manifestation du phénotype. Les gènes seraient impliqués dans l'adaptation des bactéries aux conditions de phase stationnaire. Notre hypothèse de travail propose qu'un élément de surface de la souche parentale déclenche une signalisation cellulaire entraînant la mort des mutants.

Nous poursuivons notre analyse phylogénétique des systèmes ABC et la mise à jour de la base de données ABSCISSE ( http://www.pasteur.fr/recherche/unites/pmtg/abc/database.iphtml). Nous avons récemment observé que les plantes partagent avec les bactéries un petit nombre de systèmes ABC que l'on ne trouve pas chez les animaux. Ces systèmes ABC ont probablement été transmis aux plantes par les bactéries ancêtres des chloroplastes.

Photo 1. Les systèmes Has

Photo 2. Structure 3D de l'holo et de l'apo-hémophore

Photo 3. Modélisation du récepteur HasR

Mots-clés: Transport membranaire, acquisition du fer, hémophore, protéine ABC



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DEBARBIEUX Laurent, Chargé de Recherche IP, deblaure@pasteur.fr

DELEPELAIRE Philippe, DR2 CNRS, pdelep@pasteur.fr

WANDERSMAN Cécile, Chef d'Unité IP, cwander@pasteur.fr
BENEVIDES MATOS Najla, étudiante Doctorat brésilienne najla@pasteur.fr

CESCAU Sandra, Etudiante Doctorat Université Paris 7, scescau@pasteur.fr

CWERMAN Hélène, Etudiante Doctorat, Université Paris 7 hcwerman@pasteur.fr

MURAT Dorothée, Etudiante Doctorat, Université Paris 7 murat@pasteur.fr

HUCHE Frédéric, Etudiant Doctorat Université Paris 7/ Boursier Univ.Constance, huche@pasteur.fr

LETOFFE Sylvie, Ingénieur IP, sletoffe@pasteur.fr

GONCALVES Laurent, Technicien IP/PTR

PAQUELIN Annick, Technicienne CNRS, apaquel@pasteur.fr

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