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     Résonance Magnétique Nucléaire - URA CNRS 2185


  Responsable : DELEPIERRE Muriel (murield@pasteur.fr)


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La thématique de l'Unité concerne l'étude structurale et dynamique des macromolécules biologiques en solution en relation avec leur fonction ainsi que l'étude des interactions impliquées dans les phénomènes de reconnaissance moléculaire de type DNA-protéine, protéine-protéine ou encore peptide-macromolécules. Les approches sont celles de la Biochimie et de la Biophysique avec comme méthode de choix mais sans exclusive la Résonance Magnétique Nucléaire. Les thèmes développés le sont en étroite collaboration avec les équipes de l'Institut Pasteur



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Étude structurale et fonctionnelle des protéines bactériennes impliquées dans l'acquisition de l‘hème (Célia Caillet, Izadi-Pruneyre, Anne Lecroisey, Julien Lefèvre, Karine Wecker, Nicolas Wolff)

Le fer, impliqué dans de nombreux processus biologiques, est indispensable pour les êtres vivants. Bien que très abondant, il est quasiment insoluble dans les milieux biologiques. Les bactéries ont donc développé différentes voies d'acquisition du fer qui peuvent coexister chez une même espèce. L'existence et l'utilisation de ces différentes voies dépendent de la biodisponibilité du fer dans l'organisme hôte. Ainsi des pathogènes opportunistes (Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa et Pseudomonas fluorescens) et l'agent responsable de la peste (Yersinia pestis) secrètent en condition de carence en fer des protéines, appelées hémophores (HasA pour Heme acquisition system), qui leur permettent d'accéder à la plus grande source potentielle de fer chez l'homme, l'hème de l'hémoglobine. Les hémophores HasA, une fois dans le milieu extra cellulaire, captent l'hème sous sa forme libre ou liée à l'hémoglobine et le délivrent ensuite à un récepteur membranaire spécifique. Les hémophores HasA partagent une grande homologie et forment une nouvelle famille de protéines sans homologie avec d'autres protéines connues. Afin de comprendre le mécanisme d'action de ces hémophores, nous étudions HasASM (19 kDa) sécrété par S. marcescens, le premier membre découvert de cette famille. La structure tridimensionnelle de HasASm a été déterminée, par diffraction aux rayons X pour la forme hémo- et par RMN hétéronucléaire multidimensionnelle pour la forme apo-protéine (photo 1). Trois résidus sont impliqués dans la fixation de l'hème : une histidine et une tyrosine directement liées au fer de l'hème et une autre histidine via la tyrosine. L'importance et le rôle de chacun de ces résidus dans l'activité de la protéine ont été évalués à partir de l'étude de l'état de protonation des histidines en absence et en présence du ligand mais aussi de l'étude des propriétés physico-chimiques et moléculaires de mutants dans lesquels ces résidus avaient été remplacés par d'autres résidus. L'ensemble de ces travaux nous a permis d'émettre des hypothèses sur les mécanismes de capture et de délivrance de l'hème de cette nouvelle famille de protéines. (Collaborations : Unité des membranes bactériennes, Institut Pasteur ; CNRS et Faculté de Pharmacie, Marseille, Université de Florence, Italie).

Structure tridimensionnelle de toxines (Muriel Delepierre, Karine Wecker)

L'étude de la structure des canaux ioniques a été rendue possible par l'utilisation de ligands spécifiques de chacun des canaux étudiés. Ces ligands sont souvent des toxines animales isolées à partir de venins de vertébrés et d'invertébrés et représentent des outils très puissants pour étudier la structure et comprendre la pharmacologie moléculaire de ces canaux. Bien que les bases moléculaires de la spécificité des toxines envers les espèces et/ou envers les différents types de canaux ioniques aient été beaucoup étudiées, il reste encore beaucoup à faire pour appréhender totalement les caractéristiques structurales et fonctionnelles de ces molécules. Il est donc important de continuer à caractériser les toxines au fur et à mesure de leur découverte non seulement pour les problèmes de santé publiques causés par les piqûres d'espèces venimeuses mais aussi parce qu'un grand nombre de nouvelles familles de canaux ioniques sont sans pharmacologie faute de ligand spécifique. Nous avons élucidé la structure d'une toxine de type sodium active sur les canaux potassium (collaboration Institut Pasteur de Tunis Mohamed El Ayeb) et travaillons actuellement à la détermination de structures de trois autres toxines: ( i) la discrepine une toxine active sur les canaux potassium (collaboration Lourival Possani Mexique) (ii) la toxine Pa9 de nature non peptidique, première molécule active sur les canaux potassium de type 2P (collaboration Michel Ladzunski Nice) (iii) enfin une toxine spécifique des canaux sodium à très forte activité dépressante (collaboration Michael Gurevitz Tel Aviv)

Étude structurale de déterminants antigéniques reconnus par un anticorps monoclonal protecteur dans le cadre du développement d'un vaccin contre la shigellose (Ada Prochnicka-Chalufour, Catherine Simenel, Muriel Delepierre)

Shigella flexneri est une bactérie à gram négatif responsable de la forme endémique de la shigellose, une infection recto-colique aiguë dont les principales victimes sont les enfants de moins de cinq ans dans les pays en voie de développement. L'augmentation, du nombre de souches de Shigella résistantes aux antibiotiques, rend la vaccination l'unique moyen d'éradication de la maladie. La protection contre une infection par Shigella repose essentiellement sur la réponse humorale locale dirigée contre la partie polyosidique du lypopolysaccharide appelée antigène-O (Ag-O). De plus, les anticorps conférant cette protection sont spécifiques du sérotype de la souche de Shigella définie par la structure de l'Ag-O. Une stratégie possible pour la vaccination humaine consiste donc à développer des vaccins synthétiques chimiquement définis avec des molécules simples capables de mimer l'Ag-O et d'induire la synthèse d'anticorps protecteurs. Deux approches ont été développées qui consistent à utiliser soit des oligosaccharides synthétiques représentatifs des épitopes osidiques reconnus par des anticorps protecteurs soit des séquences peptidiques mimant les épitopes protecteurs. Le développement de chacune de ces deux options requiert une étude structurale de l'interaction des oligosaccharides et des peptides avec des anticorps protecteurs afin d'appréhender les bases moléculaires impliquées dans la reconnaissance antigène-anticorps et à définir ainsi la structure optimale mimant l'Ag-O. Les structures en solution des oligosaccharides synthétiques, de l'antigène-O du sérotype 5a et des séquences peptidiques immunogéniques ont été étudiées par RMN soit sous forme libre soit sous forme liée à des anticorps protecteurs permettant de mettre en évidence le rôle du résidu glucosyl dans la structuration en hélice observée. Ces études sont maintenant étendues à la caractérisation des épitopes oligosaccharidiques du sérotype 2a (collaboration avec les Unités de Pathologie Microbienne et de Chimie Organique).

Étude structure-fonction de la protéine TgDRE, une enzyme de réparation de l'ADN exprimée par le parasite Toxoplasma gondii (Karine Frénal, Karine Wecker, Nicolas Wolff)

Le protozoaire Toxoplasma gondii est un parasite pathogène opportuniste appartenant au même phylum que le Plasmodium falciparum et responsable de la toxoplasmose chez l'homme. Son infection est asymptomatique dans la plupart des cas, mais le parasite persiste à vie sous forme latente enkystée au niveau des cellules nerveuses, rétiniennes et musculaires. Toutefois, chez les personnes immunodéprimées (cancer, sida, greffe), la forme quiescente entre en réplication active, devient virulente et peut causer la mort par encéphalite. L'interconversion entre ces deux formes est donc importante dans la réactivation de l'infection. Il semble que certains stimuli comme l'oxyde d'azote ou l'interféron γ soient impliqués dans le passage de la forme virulente à la forme latente, ce qui pourrait causer un stress pour le parasite et être à l'origine de dommages au niveau de son ADN. Une protéine de réparation de l'ADN récemment découverte chez le parasite Toxoplasma gondii, nommée TgDRE (Toxoplasma gondii DNA Repair Enzyme) serait impliquée dans l'interconversion des formes quiescente et virulente du parasite. Constituée de 466 résidus, elle forme avec quatre autres protéines une nouvelle famille caractérisée par la présence de trois domaines : deux domaines de liaison à l'ARN : les G-patch et RRM (RNA Recognition Motif) et un domaine nommé SF45 par homologie avec un domaine de la protéine humaine SF45 impliquée dans le spliceosome. Après avoir réalisé des constructions plasmidiques, exprimé et purifié des protéines mono et multidomaines de TgDRE (de 7 kDa à 25 kDa) nous avons débuté la détermination de leur structure par RMN conjointement à leur étude fonctionnelle (Collaboration Laboratoire de Minéralogie-Cristallographie de Paris, Jussieu, DIEP, CEA-Saclay, Unité Parasitologie Moléculaire, Université de Lille, Unité de Chimie Organique).

Génomique structurale de Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium leprae (Ada Prochnicka-Chalufour, Iñaki Guijarro, Muriel Delepierre)

L'Institut Pasteur est impliqué dans un projet de génomique fonctionnelle et structurale des génomes de Mycobacterium tuberculosis et Leprae, projet coordonné par Stewart Cole. L'objectif principal est le développement de nouvelles drogues pour combattre la menace sans cesse croissante de la tuberculose mais aussi la lèpre à partir d'une approche post-génomique. En effet, la lèpre, maladie humaine neurologique chronique, est due à une infection par un agent pathogène intracellulaire, Mycobacterium leprae (M. leprae), un proche parent du bacille tuberculeux (M. tuberculosis). Les génomes de M. leprae et M. tuberculosis sont aujourd'hui séquencés. Ils possèdent plus de 80 % d'identité et contiennent des gènes spécifiques à chacun d'entre eux, 136 et 470 respectivement chez M. leprae et M. tuberculosis. Parmi ceux-ci 156 sont de fonction inconnue. À court terme, l'étude des gènes spécifiques de M. leprae devrait permettre une meilleure compréhension de son fonctionnement donc de sa pathogénicité, en particulier neurologique, et pourrait fournir des outils-diagnostics précieux pour des tests cutanés de détection de la maladie, d'autant mieux traitée qu'elle est décelée précocement. À moyen terme, il s'agira d'identifier de nouvelles cibles pour de nouveaux antibiotiques, de mettre au point de nouveaux médicaments pour éviter les neuropathies et de rechercher un vaccin en identifiant des protéines fonctionnelles jouant un rôle dans l'immunité. Parmi les 156 gènes de fonction inconnue nous avons choisi ceux qui exprimaient des protéines dont la taille n'excède pas les 150 acides aminés afin de conduire une étude structurale par RMN hétéronucléaire multidimensionnelle (Collaboration Stewart Cole, Jean-Michel Betton et Pedro Alzari)

Légende :

Structure tridimensionnelle de la protéine HasASm déterminée par diffraction de rayon X pour la forme holo (à gauche) et par résonance magnétique nucléaire pour la forme apo (à droite) [collaboration Cécile Wandersman]

Mots-clés: Biophysique, RMN, structure, interactions, biomolécules, modélisation moléculaire



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DELEPIERRE Muriel (CNRS) DR1 murield@pasteur.fr

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LECROISEY Anne (IP) CR alecrois@pasteur.fr

WOLFF Nicolas (IP) CR wolff@pasteur.fr

CAILLET Célia Thèse 2ième année ccaillet@pasteur.fr

FRENAL Karine Thèse 3ième année kfrenal@pasteur.fr

GUILLIERE Florence Master 1ère année

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THEILLET François Master 1ère année

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