Notre projet de recherche est essentiellement axé sur l'étude du rôle des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) dans la pathogénèse des infections virales de l'homme et en particulier de l'infection par virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1) et par le virus de l'hépatite C (VHC). Plusieurs approches sont développées in vitro: cartographie des épitopes T et importance des réactivités croisées, présentation de particules virales exogènes aux CTL, contrôle de la réplication virale, et in vivo : reconstitution du système immunitaire dans des cohortes de patients infectés et traités par anti-rétroviraux, importance de l'induction de CTL dans l'efficacité des protocoles de vaccination dans des modèles animaux.

A. CTL et infection pédiatrique: F. Buseyne,E.Monchatre N. Bellal .en coll.avec D.Scott-Algara (I.P), S. Blanche et C.Rouzioux (CHU Necker Enfants Malades), et J. LeChenadec, J. Warsawski,(INSERM, CHU Bicêtre).

1-Depuis plusieurs années nos efforts sont focalisés sur l'étude d'une cohorte d'enfants infectés par le VIH par voie materno-fœtale. Une partie importante des enfants participent à des protocoles de thérapie anti-rétrovirale combinée avec ou sans anti-protéase. L'efficacité des traitements est évaluée par la mesure de la charge virale (plasmatique, virémie cellulaire et provirus intégré). Pour l'évaluation de l'impact du traitement sur la reconstitution du système immunitaire, les différentes populations lymphocytaires CD4+ et CD8+ (marqueurs d'activation et naif/mémoire) sont étudiées en cytométrie de flux. L'activité fonctionnelle cytotoxique (CTL) est étudiée par la technique conventionnelle de relargage au chrome et par les techniques alternatives (Elispot et tetramères).

2- Déficit fonctionnel des lymphocytes CD8+ spécifiques du VIH : L'utilisation de tétramères de la molécule HLA-A2 complexés avec deux peptides immunodominants de la p17(Gag) et de la RT (Pol) nous avait permis de montré que la grande majorité des PBMC des enfants HLA-A2 testés fixent le tétramère Gag et le tétramère Pol (Scott Algara et al, 2001). Les lymphocytes CD8+ fixant les tétramères ont le phénotype suivant: CD28-CD45RA-CD45RO+HLADR+CD69-. Des dysfonctions du système immunitaire en particulier des fonctions de sécrétion de cytokines et des fonction de cytotoxicité ont été mises en évidence dans des modèles d'infections expérimentales murines et chez certains patients infectées par le VIH. De telles dysfunctions pourraient jouer un rôle dans l'immunopathologie de l'infection VIH chronique. Les lymphocytes CD8 + spécifiques d'épitopes du VIH - détectés par leur attachement à des complexes-tétramères-peptides - ont été étudiés pour leurs fonctions de sécrétion des cytokines (IFNα, TNFα) et chemokines (RANTES, MIP-1α et MIP-1β), lymphokines impliquées dans les fonctions de cytotoxicité et dans les mécanismes de contrôle de la réplication virale par les lymphocytes CD8+. Les résultats montrent qu'une fraction importante des lymphocytes CD8+ spécifiques du VIH ont un déficit fonctionnel multiple car une proportion importante est incapable, à la suite d'une stimulation antigénique spécifique, de sécréter de l' IFNγ, du TNFα, RANTES et/ou du MIP-1β (Scott-Algara et al sous presse).

B . Présentation de particules virales du VIH exogènes aux lymphocytes CD8+: rôle des particules virales non réplicative dans l'induction d'effecteurs CD8+. F.Buseyne,C. Retiere, M. Nowakowski ,en coll avec A. Morris, O. Schwartz (I.P) et J.P Abastado (IDM, Paris).

Les cellules dendritiques et les macrophages présentent les particules du VIH aux lymphocytes T CD8+ en absence de réplication virale. Le projet a pour objectif de déterminer le rôle des particules du VIH non réplicatives dans l'induction de lymphocytes T CD8+ spécifiques du virus. Pour déterminer le rôle des particules virales non infectieuses dans l'induction de lymphocytes T CD8+ spécifiques du VIH, des cellules dendritiques incubées avec des particules virales non réplicatives exogènes et des cellules dendritiques infectées productivement seront comparées pour leur capacité à induire des lymphocytes T CD8+ anti-VIH in vitro.

C . Inhibition de la réplication virale par les lymphocytes CD8+. M. Février, en coll avec A. Talarmin, I.P Guyane.

L'objectif du travail était de déterminer si la fonction de contrôle de la réplication de VIH, sans cytolyse, était exercée spécifiquement par un des sous-types de cellules CD8+: Tc0, Tc1 ou Tc2. Des clones T CD4+ et CD8+ ont été établis à partir de cellules du sang périphérique de sujets séronégatifs et séropositifs pour VIH. La classification en type cellulaire a été faite sur la détection de la production des cytokines prototypes (IFNγ et IL4) par marquage intracytoplasmique. Des cellules T CD4+ [de type Th0, Th1 et Th2] ont été infectées avec un virus R5 (YU2b) ou un virus X4 (LAI) et mises en coculture avec les différents sous-types de cellules T CD8+. Il ressort de cette étude que YU2b est beaucoup moins bien contrôlé que LAI quel que soit le type de cellules CD4+ infectées (si on regarde la fréquence des clones qui contrôlent); tous les sous-types de cellules T CD8+ sont capables de contrôler LAI quel que soit le type des cellules infectées (Th0, Th1 ou Th2) (Février et al, J. Clin. Immunol., 2004,

D. Modèles animaux: immunisation à base d'ADNs chez le macaque. En collaboration avec A.L Puaux et M.L. Michel (INSERM U163, Institut Pasteur), R.LeGrand (CEA, Fontenay) et AM Aubertin, (INSERM, Strasbourg).

Comme approche vaccinale pour lutter contre l'infection par le VIH-1 deux stratégies sont combinées : d'une part, pour favoriser la réponse humorale et cellulaire, un système de présentation d'épitopes utilisant comme molécule porteuse l'antigène de surface du virus de l'hépatite B (AgHBs); d'autre part, pour stimuler la réponse cytotoxique, une vaccination à base d'ADN utilisant des vecteurs codant pour des domaines antigéniques de SIV et de VIH-1 fusionnés à cet antigène. Le macaque est le modèle animal utilisé dans cette étude puisqu'il présente l'avantage de pouvoir être éprouvé par infection avec un virus chimérique SHIV portant l'enveloppe de VIH-1. L'immunogénicité de nouveaux vecteurs ADN codant pour des domaines antigéniques de l'enveloppe de VIH-1, de la capside et de la protéine nef de SIV a été étudiée. Une épreuve virulente a été effectuée avec un virus chimère SHIV portant l'enveloppe d'un isolat bitropique. Les réponses T induites par l'ADN hybrides ont été rappelées par une injection de MVA recombinant. Les macaques immunisés sont infectés mais ont montré une protection partielle contre l'épreuve virulente attesté par le contrôle de la charge virale plasmatique (Puaux et al. Vaccine, 2004) .

E- Réponses cellulaires T spécifiques du virus de l'hépatite C (VHC) chez des sujets exposés non infectés G. Janvier, en coll avec S. Pol, Hépatologie, JL Bresson C.I.C , ML Chaix, Virologie, CHU Necker-Enfants Malades.

Dans l'infection VHC, la réponse immune joue un rôle important dans l'élimination du virus ou la persistance virale. Pendant la phase aiguë, les réponses T corrèlent avec l'élimination du virus. L'évolution vers une infection chronique est associée à l'affaiblissement des réponses immunes médiées par les cellules T. Le but de ce travail a été d'étudier le rôle de la réponse T spécifique de la protéine Core chez des individus exposés mais non infectés et d'identifier les épitopes T spécifiques de core impliqués dans la protection.Nous avons caractérisé, par test Elispot IFNγ_ les réponses spécifiques de la protéine core de VHC à partir de PBMC fraîchement isolées et de PBMC stimulées in vitro, de 20 individus exposés non infectés et des 20 partenaires infectés par VHC et de 20 volontaires non exposés non infectés.In vivo, la fréquence des réponses effectrices T était faible et aucune différence n'a été observée entre les trois groupes. In vitro, la fréquence des répondeurs était plus élevée dans les groupes des porteurs chroniques et des exposés non infectés comparé au groupe des non exposés non infectés. Les régions N-terminale et centrale de la protéine core étaient les cibles principales des réponses T mémoires détectées après stimulation in vitro. Ces résultats sont en faveur d'un rôle protecteur des réponses cellulaires T spécifiques du virus chez les exposés non infectés.

Mots-clés: VHC, CTL, VIH-1, Enfant, Reconstitution immunitaire, Présentation antigénique