Portail IP   bandeau_genéral
imprimer
Imprimer
     Immunité innée et signalisation


  Responsable : Philpott, Dana (philpott@pasteur.fr)


  resume

 

Notre groupe étudie la réponse immunitaire innée induite par une famille de protéines cytosoliques appelé NBS/LRR (nucleotide-binding site/leucine-rich repeat). Leur structure est très proche de celles des protéines de résistance connues chez les plantes (R proteins). Les deux protéines de cette famille les mieux caractérisées sont Nod1 et Nod2. Elles détectent différents résidus du peptidoglycane, constituant de la paroi bactérienne. Nous avons montré que Nod1 joue un rôle important au cours de l'infection, dans la reconnaissance par les cellules épithéliales de bactéries à Gram négatif comme Shigella flexneri ou Helicobacter pylori.



  rapport

cale

Implications des protéines Nod et des PGRP dans les processus de défense immunitaire innée

Les protéines Nod1 et Nod2 sont des protéines intracellulaires récemment impliquées dans la défense immunitaire innée. Ces protéines jouent un rôle de surveillance intracellulaire en détectant des motifs distincts du peptidoglycane (PGN) bactérien. La reconnaissance par Nod1 et Nod2 des motifs microbiens initie une cascade pro-inflammatoire de signalisation via NF-κB, nécessaire à la clearance des bactéries pathogènes de l'hôte. Nous avons récemment démontré que le produit naturel de dégradation du peptidoglycane reconnu par Nod1 est le GlcNAc-MurNAc-L-Ala-D-Glu-meso-DAP (GM-triDAP). Cependant la structure minimale reconnue est le dipeptide D-Glu-meso-DAP, dans lequel l'acide aminé meso-DAP se trouve en position terminale (Figure 1). La présence de meso-DAP est caractéristique de la plupart des bactéries à Gram négatif plus de quelques bactéries à Gram positif comme les espèces Bacillus et Listeria. La spécificité de Nod1 de détecter les bactéries à Gram négatif représente certainement un avantage sélectif pour l'hôte puisque ces bactéries représentent une menace majeure pour les cellules épithéliales recouvrant la muqueuse intestinale. Au contraire il a été montré que Nod2 reconnaît à la fois les peptidoglycanes des bactéries à Gram positif et à Gram négatif. Des études biochimiques et fonctionnelles ont identifié le muramyl dipeptide MurNAc-L-Ala-D-isoGln (MDP), qui constitue le motif minimal de tous les PGN, comme étant la structure reconnue par Nod2 (Figure 1). Des mutations de Nod2 ont été associées à des maladies humaines auto-immunes comme la maladie de Crohn, une maladie inflammatoire de l'intestin, et le syndrome de Blau, qui affecte les articulations et les yeux. De manière intéressante, la mutation de Nod2 la plus couramment rencontrée chez les patients atteints de la maladie de Crohn, est une mutation du cadre de lecture qui résulte en une protéine tronquée d'une répétition LRR terminale ne détectant plus le MDP. Bien que les implications de ces découvertes ne soient pas encore clairement comprises, il apparaît que l'absence de reconnaissance des motifs bactériens par les protéines mutantes de Nod2 contribue à la pathologie de ces maladies. Une perte de la surveillance par Nod2 pourrait résulter en l'incapacité des réponses immunitaires de la muqueuse intestinale à contrôler l'infection bactérienne, ce qui initierait une réponse systémique et conduirait à une réponse inflammatoire massive.

Notre laboratoire essaie de comprendre le rôle des molécules de reconnaissance du PGN incluant les protéines Nod et les PGRP, dans la présentation du PGN au système immunitaire inné. Nous voulons également mieux comprendre les mécanismes moléculaires d'activation des protéines Nod en étudiant la structure de Nod1 et de Nod2 et leur liaison avec leurs ligands ainsi que leur interaction avec d'autres partenaires aboutissant à l'activation des voies de signalisation.

De plus, nous disposons au laboratoire de souris déficientes pour Nod1 et pour Nod2 que nous utiliserons comme modèle murin d'infection et d'étude de la défense de l'hôte contre des infections bactériennes,.

Nous nous intéressons également à la contribution des protéines Nod à la signalisation induite par les récepteurs TLR, et à son rôle dans l'établissement d'une réponse immunitaire adaptative.

Projets actuels et perspectives de recherche de notre laboratoire 

1.Nod1 :de la détection du ligand à la transduction du signal

a) Détermination de l'interaction de Nod1 et de Nod2 avec leurs ligands; analyse structure/fonction du domaine riche en leucines de Nod1 (Muguette Jéhanno Tech Sup IP, en collaboration avec Stephen Girardin, Patrick England (Plate-Forme de Biophysique des Macromolécules et de leurs Interactions), Frederic Pecorari and Pedro Alzari (Plate-Forme 6 - Cristallogénèse et Diffraction des Rayons X ).

Notre but est d'examiner si Nod 1 interagit directement avec son ligand ou si cette interaction est indirecte via de possibles co-récepteurs. Actuellement, pour les TLR, très peu de données montrent une interaction directe de ces récepteurs avec leurs ligands respectifs. Pour tester l'interaction de Nod1 et de Nod2 avec leurs ligands, nous examinerons in vitro la liaison de Nod1 avec son ligand et à l'aide d'un modèle moléculaire prédictif, nous déterminerons les sites potentiels d'interaction. Les études d'affinité seront analysées par BIACORE avec la protéine Nod1 sauvage ainsi qu'avec des mutants que nous avons générés par mutagénèse dirigée dans la poche putative de liaison. Jusqu'à présent nous avons muté 40 acides aminés de ce site et 4 de ces mutations affectent sévèrement la détection de Nod1.Nous sommes en train d'étudier ces mutants plus en détail pour comprendre l'origine du défaut de fonctionnalité.

Si l'interaction est en effet directe, nous pouvons envisager l'analyse cristallographique de Nod1 avec son ligand en collaboration avec la plateforme de cristallographie dirigée par Pedro Alzari.

b) Interaction de Nod1 avec son ligand ou d'éventuels partenaires moléculaires : approches cellulaires (Thomas Küfer, stagiaire post-doctoral).

En parallèle du travail décrit précédemment, nous examinons l'interaction de la protéine Nod1 avec les résidus de PGN qu'elle détecte ainsi que des partenaires agissant dans la cascade de signalisation. En utilisant un anticorps dirigé contre Nod1, produit au laboratoire, des expériences de co-immunoprécipitation seront réalisées dans un contexte d'infection par des bactéries à Gram négatif. Nous pourrons alors déterminer si lors de l'infection Nod1 interagit directement avec son ligand (des anticorps dirigés contre les motifs du PGN sont en en cours d'obtention).

Si cette interaction n'est pas directe la technique permettra de mettre en évidence les éléments nécessaires à cet événement. Ceci peut être réalisé par marquage à l'argent des immuno-précipités, suivi d'une étude par spectrométrie de masse. En parallèle, une étude par la technique du double hybride chez la levure a été commencée, utilisant la protéine entière ou différents domaines, LRR, NBS ou CARD.

c) Rôle des "peptidoglycan recognition proteins", PGRP : (Rafika Athman, stagiaire post-doctoral).

Les PGRP chez la drosophile ont été montrées comme étant cruciales dans le système de défense de l'organisme. Les mammifères possèdent 4 PGRP, cependant leur rôle dans l'immunité innée reste à éclaircir. Par exemple les souris n'exprimant pas les PGRP-L ou PGRP-S n'ont pas de difficultés à lutter contre les infections bactériennes. Nous avons examiné la contribution potentielle des PGRP dans la reconnaissance bactérienne par les protéines Nod. L'expression des PGRP semble être augmentée au cours d'infections ou lors de traitement des cellules par les ligands des protéines Nod. Les prochaines études se focaliseront sur les mécanismes de régulation d'expression ainsi que la contribution des PGRP dans la réponse induite par la voie des protéines Nod.

2. Analyse du rôle de Nod1 in vivo.

(Jérôme Viala (étudiant en thèse), Lionel LeBourhis (étudiant en DEA), en collaboration avec Catherine Chaput, Ivo Boneca, Richard Ferrero (Unité de Pathogénie Bactérienne des Muqueuses), Stephen Girardin, Philippe Sansonetti (Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire), John Bertin et Peter DeStefano, (Millennium Pharmaceuticals, Cambridge MA).

L'étape la plus importante pour déterminer le rôle de la protéine Nod1 est de valider les résultats obtenus in vitro dans des modèles in vivo. John Bertin de Millennium Pharmaceuticals nous a fourni les souris génétiquement invalidées pour le gène nod1. Elles n'ont pas de phénotype spontané.

a) Souris déficiente Nod1 : culture primaire

Les fibroblastes de souris possèdent un système TLR capable de reconnaître des motifs bactériens extracellulaires, excluant de ce fait leur utilisation pour notre étude. Nous avons donc développé et affiné une technique d'isolement de cellules épithéliales gastriques et intestinales. Comme les lignées cellulaires connues, ces cellules primaires sont dépourvues d'un système TLR fonctionnel, détectant les bactéries extracellulaires ou leurs constituants. Ce manque d'activation de NF-κB est en accord avec le milieu physiologique de ces cellules, étant en contact permanent avec une flore commensale. En revanche la présentation intracellulaire d'extraits de bactéries à Gram négatif (par micro-injection) ou lors d'une infection par S. flexneri), active la voie NFκB. Cet effet n'est pourtant visible que pour les cellules issues de souris sauvages contrairement aux souris déficientes pour le gène nod1 bien que ces cellules puissent être activées par le TNF-α Ces résultats montrent l'importance de Nod1 dans la détection intracellulaire de bactéries à Gram négatif. D'autre part, ces cellules sont incapables de détecter des bactéries à Gram positif, ce qui laisse supposer que Nod1 est la seule molécule sentinelle dans les cellules épithéliales.

b) Modèle d'infection in vivo

Le travail décrit ci-dessus montre que dans les cellules épithéliales, Nod1 détecte des produits bactériens intracellulaires au cours d'invasions bactériennes. Nous avons montré récemment que cela est aussi possible pour certaines bactéries extracellulaires, comme Helicobacter pylori qui stimule également Nod1. La stimulation de ce récepteur intracellulaire est dépendante de la livraison du peptidoglycane dans la cellule hôte par l'appareil de sécrétion de type IV de H. pylori. Cette "seringue moléculaire" permet à la bactérie de délivrer des composants bactériens dans les cellules épithéliales. L'importance de Nod1 est d'autant plus soulignée par la plus grande sensibilité à l'infection par H. pylori des souris déficientes par rapport aux sauvages. Plus de 100 fois plus de bactéries ont été dénombrées dans les estomacs des souris mutées comparé aux contrôles (Figure 2).

c) Compréhension du rôle antibactérien de Nod1

La question suivante dans ce projet est de comprendre comment Nod1 joue un rôle dans la clairance des bactéries. Notre hypothèse est que Nod1 déclenche la production de facteurs anti-microbiens par les cellules épithéliales qui aident à la destruction de bactéries. Nous avons pu montrer que Nod1 est impliqué dans la production de β défensines dans des cellules infectées par H. pylori. Une construction de Nod1 agissant comme un dominant négatif est capable de bloquer l'activation par H. pylori du plasmide rapporteur luciférase β défensines. De plus, la stimulation de Nod1 par son ligand est capable d'activer ces mêmes promoteurs. De prochaines études essayeront d'examiner le rôle de Nod1 dans l'induction des défensines in vivo.

3) Mise en route de la réponse immunitaire adaptative : rôle de Nod1 et Nod2Jörg Fritz, stagiaire post-doctoral en collaboration avec Stephen Girardin, Philippe Sansonetti, PMM, Minou Adib-Conquy et Jean-Marc Cavaillon,UCI, Jean-Pierre Hugot et Marco Giovaninni, CEPH pour les souris déficientes Nod2 et Mathieu Allez, Hôpital St Louis pour les biopsies humaines).

Lors d'une infection, une cellule hôte est confrontée à un microbe entier, exprimant simultanément de nombreux PAMPs et non à des PAMPs isolés. Ainsi il est important d'étudier individuellement la fonction des PRR qui reconnaissent les différents PAMPs, mais aussi l'effet combiné de l'engagement simultané de nombreux PRR. Des résultats récents suggèrent que les cellules des patients atteints de la maladie de Crohn montrent des réponses altérées pour des ligands des TLR. Il apparaît ainsi que l'absence de Nod2 compromet un " frein" moléculaire essentiel à limiter la réponse inflammatoire générée lors de la reconnaissance de bactéries via TLR2. C'est pourquoi nous avons pour projet l'étude des relations croisées entre les TLR et les Nod (Nod1 et Nod2) et l'impact de ces interactions sur le développement des réponses immunitaires lors d'infections bactériennes.

Dans les leucocytes comme les macrophages ou les cellules dendritiques, un large répertoire de protéines TLR et Nod sont exprimées pour détecter la présence des bactéries ou de leur produits. Alors qu'il a été montré que les systèmes de reconnaissance des TLR et des Nod fonctionnent indépendemment pour déclencher des réponses pro-inflammatoires, l'existence de réponses synergiques induites par les TLR et les Nod n'ont pas encore été caractérisées.

Des résultats préliminaires ont été obtenus pour identifier les conditions optimales dans lesquelles les ligands des Nod (M-TriDAP and MDP, pour Nod1 et Nod2, respectivemernt) augmentent les réponses pro-inflammatoires induites par les ligands des TLR (LPS, lipoprotéines, CpG DNA, etc..). La synergie entre les réponses TLR et Nod seront tout d'abord étudiées en terme de production de cytokine (TNF, IL-6, IL-1b, IL-10, IL-12, IL-1a). De plus dans le cas de cellules dendritiques la détection en FACS de l'expression des molécules membranaires de co-stimulation (comme HLA-DR, CD86, CD80, CD40, CD83) sera réalisée après stimulation des cellules par des ligands des TLR avec ou sans ligands des Nod. Nous utiliserons des monocytes préparés à partir de sang humain ainsi que des macrophages péritonéaux. De plus des cellules dendritiques humaines ou murines seront dérivées pour des études in vitro.

Dans le modèle humain, les relations croisées entre les réponses TLR et Nod seront étudiées à partir des leucocytes isolés de patients atteints de la maladie de Crohn présentant des mutations ou non dans le gène CARD15/Nod2. Les monocytes et cellules dendritiques isolés de ces patients seront isolés et préparés comme décrit précédemment. En ce qui concerne le modèle murin, nous disposerons de la collection de souris génétiquement invalidées déjà disponible Nod1-/-, Nod2-/-, TLR2-/-, TLR4-/-, MyD88-/-, TLR2/4-/-. Les macrophages ou les cellules dendritiques seront stimulées in vitro avec différents ligands des TLR ou des Nod ou avec des bactéries entières à Gram-négatif ou à Gram positif. Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre les contributions relatives des TLR et des protéines Nod à la production de cytokines, à la différentiation et à la maturation cellulaire en réponse à différents ligands et bactéries entières.

Légendes des photos :

Figure 1: Produits de dégradation naturels (rouge ou vert) et minimaux (bleu ou orange) du peptidoglycane reconnus par Nod1 et Nod2. La structure minimale de peptidoglycane (PGN), produite naturellement, détectée par Nod1 est le squelette sucré composé de N-acetylglucosamine (GlcNAc) et d'acide N-acetylmuramique (MurNAc) lié au peptide de base L-Ala-g-D-Glu-meso-DAP (GM-triDAP). La structure minimale de PGN détectée par Nod1 est le dipeptide D-Glu-meso-DAP, pour lequel l'acide aminé meso-DAP se trouve en position terminale. Nod2 détecte comme composé naturel du PGN le GlcNAc-MurNAc lié au L-Ala-g-D-Glu, le motif minimal reconnu étant le MurNAc-L-Ala-g-D-Glu (MDP).

Figure 2: Charges bactériennes dans l'estomac de souris sauvage ou déficientes Nod1 à sept et trente jours post-infection. Les souris déficientes pour Nod1 comme les souris sauvages ne parviennent pas à limiter la croissance bactérienne.

Mots-clés: Nod1, Nod2, immunité innée, maladie de Crohn, infections bactériennes



  publications

puce Toutes les publications 2004 sur notre base de données


  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Lambrecht, Régine (lambrech@pasteur.fr)   Fritz, Jörg (post-doc, jfritz@pasteur.fr)

Kufer, Thomas (post-doc, kufer@pasteur.fr)

Viala, Jérome (PhD student, vialaj@pasteur.fr)

Athman, Rafika (post-doc, rathman@pasteur.fr)

LeBourhis, Lionel (DEA, lebourhi@pasteur.fr)

Jéhanno, Muguette (technicienne, mjehanno@pasteur.fr)

Parmier, Martine (aide de laboratoire, parmier@pasteur.fr)


Rapports d'activité 2004 - Institut Pasteur
filet

Debut de Page recherche Portail Institut Pasteur

En cas de problèmes, de remarques, ou de questions concernant cette page Web écrire à rescom@pasteur.fr