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     Immuno-Hématologie et d'Immunopathologie


  Responsable : Guillaume DIGHIERO (dighiero@pasteur.fr)


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Les travaux de l'Unité ont été consacrés à : 1) l'étude des mécanismes à l'origine de la sous-expression du récepteur B dans la LLC et des défauts fonctionnels de celui-ci ; 2) l'étude des mécanismes régulant l'expression de l'AID (activation induced cytidine deaminase) ; 3) l'étude des profils d'expression génique dans la LLC par la technique des puces à ADN et l'application potentielle de l'expression des gènes exprimés différentiellement comme marqueurs pronostiques de la maladie et 4) la recherche d'un agent pathogène viral dans la LLC



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IMMUNOPATHOLOGIE DE LA LEUCEMIE LYMPHOIDE CHRONIQUE (LLC)

Introduction

La leucémie lymphoïde chronique B (LLC-B) est la forme la plus fréquente de leucémie dans les pays occidentaux. C'est une maladie correspondant à l'accumulation lente et progressive de lymphocytes B petits et matures ayant une origine clonale commune et dont la survie est prolongée par un défaut d'apoptose. Les cellules B de LLC présentent un phénotype caractéristique défini par l'expression de faibles taux du récepteur pour l'antigène (BCR) et l'expression constante de CD5 et CD23.

C'est une maladie tumorale avec une évolution relativement lente, puisque la médiane de survie dépasse 7 ans. Certains patients ont une espérance de vie qui n'est pas modifiée par l'existence de l'hémopathie, ne sont pas traités et meurent de pathologies non associées. D'autres vont mourir dans des délais variables de complications liées à la maladie. Il est donc fondamental de disposer dès le diagnostic de critères qui permettent d'évaluer le risque individuel de progression afin de pouvoir proposer une stratégie thérapeutique. En 1994, nous avons montré pour la première fois (Schroeder et Dighiero) que la moitié des LLC exprimaient des gènes d'Immunoglobulines (Ig) comportant des mutations somatiques dans la partie variable, alors que l'autre moitié ne présentait pas de mutations somatiques. Des travaux récents ont montré que le profil mutationnel des gènes Ig est le facteur pronostique le plus puissant dans cette maladie, puisque la présence de mutations dans les gènes Ig est associée à un bon pronostic alors que l'absence de mutations l'est avec un mauvais pronostic.

1) Mécanismes à l'origine de la faible expression du récepteur pour l'antigène (BCR) dans la LLC (Responsables : B. Payelle-Brogard et F. Vuillier en collaboration avec C. Magnac et G. Dumas).

Contrairement aux autres hémopathies malignes du lymphocyte B mature, le clone tumoral de la LLC exprime d'une façon caractéristique de faibles taux du BCR. Le BCR est composé de l'Ig de membrane (Igm) complexée à un hétérodimère CD79a/CD79b qui assure la transmission du signal à travers les motifs ITAM. Ce défaut d'expression du BCR se traduit par une anomalie de transduction du signal, lors de l'activation par l'antigène, entraînant une réponse proliférative défectueuse, une phosphorylation des tyrosines et une mobilisation calcique anormales. Toutefois, les mécanismes à l'origine de cette sous-expression demeurent inconnus.

Nos résultats ont montré que la sous-expression du BCR n'était pas due à des anomalies génétiques, ou à des anomalies au niveau de la transcription des gènes codant pour les molécules CD79b, CD79a et Igm (Payelle-Brogard et al Blood 1999, Br J Haematol 2002 et Leukemia 2003).

Nous avons alors étudié la synthèse protéique et le transport intracellulaire des différents composants du BCR. En effet un contraste persistait entre la synthèse protéique intra-cytoplasmique apparemment normale du BCR et sa très faible expression membranaire. Nous avons défini le profil de glycosylation des différents composants du BCR en étudiant leur résistance respective à l'Endoglycosydase H (Endo-H) qui a la propriété de couper les glycoprotéines immatures résidentes dans le réticulum endoplasmique (RE). Après transport au niveau du Golgi, les glycoprotéines vont compléter leur glycosylation et devenir résistantes à l'Endo-H. Dans le cas où une glycoprotéine n'aboutit pas à un repliement adéquat ou lorsque sa glycosylation est défectueuse, elle sera retenue au niveau du RE par des protéines chaperons, dont la plus importante est la Calnexine. Les lymphocytes B de patients atteints de LLC sont caractérisés par: 1) une prédominance de chaînes µ et CD79a immatures, sensibles à l'Endo-H et résidentes dans le RE comme le montre leur co-localisation avec la Calnexine, alors que la chaîne CD79b mature est localisée au niveau du Golgi (révélé par l'anticorps TGN46) (Figure 1) ; et 2) l'existence d'un assemblage très insuffisant des composants du BCR puisque limité à un nombre très restreint de formes matures, résistantes à l'Endo-H .

Ces résultats montrent pour la première fois que la sous-expression du BCR à la surface du lymphocyte B dans la LLC est la conséquence d'un défaut de glycosylation et de repliement des chaînes µ et CD79a à l'origine d'un assemblage imparfait de tous ses constituants (Vuillier et al Blood, 2004).

Ces anomalies de glycosylation et de repliement seront recherchées pour d'autres récepteurs sous-exprimés dans la LLC comme le CD22, CD40 et CD45. Une analyse de l'ensemble des protéines glycosylées par électrophorèse bidimensionnelle permettra d'évaluer l'étendue du défaut de glycosylation.

Les anomalies d'expression du BCR, de transduction du signal et de trafic intra-cellulaire dans la LLC, nous amènent à explorer les mécanismes de recrutement des récepteurs membranaires dans les radeaux lipidiques, élément clé dans le processus de transduction du signal à partir des récepteurs membranaires et particulièrement du BCR. Une analyse de la constitution protéique des radeaux lipidiques dans le lymphocyte B de LLC (étude statique) et leur réorganisation suite à des stimulations pouvant mimer l'interaction du lymphocyte B avec le micro-environnement (étude dynamique) sera réalisée. Ce projet, à reçu l'aval scientifique et le financement de la Ligue contre le Cancer.

2) Etude des mécanismes régulant l'expression de l'AID (activation induced cytidine deaminase) (Responsables : G. Dighiero avec P. Oppezzo et G. Dumas).

L'AID joue un rôle clé dans les processus de mutation somatique (MS) et commutation isotypique (CI) du lymphocyte B normal. Nous avons démontré que dans la LLC on observait fréquemment l'expression simultanée, dans un même lymphocyte B, de transcrits μ, d et γ exprimant le domaine variable du clone tumoral (Oppezzo et al Leukemia, 2002). Nous avons étudié l'expression de l'AID dans des cellules de LLC, comparativement à celle des lymphocytes B normaux après stimulation par la voie CD40L (l'AID n'est pas exprimée constitutivement dans le lymphocyte normal). Nos résultats montrent que les lymphocytes B de LLC qui expriment constitutivement l'enzyme, ont un processus de CI actif caractérisé par l'expression simultanée dans la même cellule de transcrits μ, d et γ et parfois α et de nombreuses mutations dans la région " pre-switch μ  ", sans qu'il y ait de MS au niveau du domaine VDJ des gènes de l'Ig. Après stimulation par la voie CD40L, une surexpression de l'AID est obtenue chez les malades exprimant constitutivement l'enzyme et une expression constante dans les autres cas. L'expression de l'AID est associée à l'induction d'une CI et de MS au niveau de la région " pre-switch µ ", mais pas au niveau du domaine VDJ (Oppezzo et al Blood, 2003), favorisant l'idée que le processus de MS requiert la présence de facteurs autres associés à l'AID.

Plusieurs facteurs de transcription sont impliqués dans l'expression de l'AID : NFkB, STAT-6, Pax-5, Id-2 et prdm-1. Nous avons étudié le rôle des gènes Pax-5, Id-2 et prdm-1. Pax-5 est un facteur de transcription engagé pendant tout le développement du lymphocyte B, et impliqué directement dans la régulation de l'AID (Gonda et al J Exp Med 2003). Id-2 est un inhibiteur de différenciation qui semble contrôler l'action de Pax-5, alors que prdm-1 codant pour la protéine BLIMP-1 joue un rôle régulateur négatif dans l'expression de la protéine BSAP codé par Pax-5. prdm-1 est exprimé dans le lymphocyte B mature une fois que la cellule a accompli le processus de CI.

Nos résultats ont montré que l'expression constitutive d'AID et l'existence d'un processus actif de CI sont associées à une expression forte du gène Pax-5 dans sa forme complète (appelée Pax-5a). Par contre les cellules qui n'expriment pas l'AID et n'ont pas de CI, présentent une expression réduite de Pax-5a et expriment une nouvelle forme issue de l'épissage alternatif de ce gène. Ce dernier transcrit (Pax-5/Δ Ex8) présente une délétion complète de l'exon 8, entraînant une perte importante du domaine activateur. Ceci nous a conduit à postuler qu'un mécanisme d'autorégulation du gène Pax-5 pourrait contrôler l'expression de l'AID.

Pour vérifier cette hypothèse nous avons stimulé avec CD40L+IL-4 les cellules qui expriment l'AID constitutivement (AID+) et celles que ne l'expriment pas (AID-). Cette stimulation induit l'expression de l'AID dans les cellules AID(-), diminue, voire supprime, l'expression de Pax-5/Δ Ex8 et induit un processus de CI. De plus, chez les malades AID(+) et AID(-) nous avons constaté que: a) l'expression des transcrits Id-2 est inversement corrélée à la présence unique de Pax-5a dans les cellules activées alors qu'elle est augmentée quand Pax-5/Δ Ex8 est présent, b) l'expression du gène prdm-1 est aussi augmentée significativement chez les malades AID(-) qui possèdent aussi la forme épissée Pax-5/Δ -Ex8. Ces résultats suggèrent que l'expression de l'AID et consécutivement de la CI sont contrôlées par un mécanisme complexe dans lequel interviennent plusieurs facteurs de transcription, parmi lesquels Pax-5 semble jouer un rôle important.

Pax-5/Δ Ex8 pourrait contrôler l'expression de l'AID par un mécanisme de compétition avec Pax-5a. Dans ce cas l'isoforme épissée devrait être capable de se lier au promoteur de l'AID et ainsi interférer avec la liaison de Pax-5a entraînant une diminution de l'expression d'AID ainsi qu'une action négative sur le processus de CI. Nous avons recherché par immuno-blot ces 2 isoformes : elles apparaissent chez un malade AID(-) et seule l'isoforme complète est retrouvée chez un malade AID(+). Par la technique du gel de retard nous avons mis en évidence que les deux isoformes de BSAP sont capables de se lier au promoteur de l'AID, ce qui serait en faveur d'une compétition entre les deux isoformes dans la régulation de l'expression de l'AID (Oppezzo et al Blood, 2004). Ce projet a reçu l'aval de l'ARC.

3) Etude des profils d'expression génique dans la LLC par la technique des puces à ADN et de l'application potentielle de l'expression des gènes exprimés différentiellement comme marqueurs pronostiques de la maladie (Responsables : G. Dighiero avec Y. Vasconcelos, P. Oppezzo, G. Dumas en collaboration avec F. Davi, H. Merle-Béral et C. Settegrana (Hôpital Pitié-Salpêtrière)

Le pronostic des malades exprimant des gènes d'Ig non-mutés étant beaucoup plus grave que celui des malades exprimant des gènes mutés, suggère que la LLC ne serait plus une maladie unique, mais deux maladies, selon le niveau mutationnel des gènes des Ig, des lymphocytes B malins.

Dans un projet, sélectionné par la Ligue contre le Cancer dans le cadre de l'appel d'offres CIT2 (Carte d'Identité des Tumeurs), pour l'étude de l'expression génique dans les cancers, nous avons comparé le profil d'expression génique de 18 malades, 9 présentant des formes très stables de la maladie et exprimant des gènes d'Ig mutés et 9 formes agressives exprimant des gènes Ig non mutés. Malgré le fait que ces deux formes à pronostic très différent aient des profils d'expression génique distincts, il existe une signature unique d'expression génique dans la LLC. Une analyse supervisée a montré une expression différentielle de 85 gènes parmi les 12.000 exprimés qui étaient surexprimés soit par les formes mutées soit par les formes non mutées. Ces résultats ont été confirmés en employant des techniques de RT-PCR quantitative (Vasconcelos et al Leukemia, en révision).

A l'aide des puces d'ADN, nous avons cherché un marqueur qui permette de prédire l'état mutationnel des gènes des Ig. L'expression à des taux importants des gènes de la lipoprotéine lipase (LPL) et de la tyrosine-kinase ZAP-70 apparaît corrélée avec l'expression de gènes non mutés, alors que l'expression accrue du gène de la métalo-protéinase ADAM29 est corrélée avec l'expression de gènes d'Ig mutés.

Afin de déterminer la valeur pronostique de l'expression de ces gènes nous avons étendu cette étude à 127 malades, chez lesquels nous avons étudié l'expression de LPL et ADAM29 par PCR quantitative et par une PCR multiplex mise au point dans le laboratoire, ainsi que l'expression de ZAP-70 par cytométrie de flux. L'étude du rapport LPL/ADAM (L/A) par RQ-PCR permet de prévoir avec un indice de Prédiction Positive (PPV) de 91 % pour les formes non mutées et un indice prédictif négatif (NPV) de 86 % pour les formes mutées. Il existe aussi une très bonne corrélation entre la positivité pour ZAP-70 et L/A+ et la présence d'une expression de gènes d'Ig sous une forme non mutée. De même, il existe une très bonne corrélation entre la négativité de ZAP-70 et L/A et la présence d'une expression de gènes d'Ig sous une forme mutée. Nous avons développé une technique de PCR en multiplex où LPL et ADAM sont amplifiés simultanément par PCR. Nous avons pu évaluer ce test sur 95 patients et déterminer sans ambiguïté le profil mutationnel des gènes d'Ig dans 89 cas. Une très bonne corrélation avec la technique de RQ-PCR a été aussi observée. Nos résultats ont permis de démontrer l'intérêt pronostique de l'étude conjointe de l'expression de LPL et ADAM. Elle permet une évaluation pronostique semblable à celle de ZAP-70 et du profil mutationnel des Igs chez les stades initiaux de la maladie (stades A) et semble supérieure à ces deux marqueurs pour les stades avancés (stades B et C), (Oppezzo et al Blood, en révision).

4) Recherche d'un agent pathogène viral dans la LLC (Responsable : Evie Melanitou en collaboration avec O. Pritsch, G. Dumas et F. Vuillier)

Diverses observations suggèreraient une origine virale de la LLC, sans pour autant pouvoir fournir une évidence définitive de la présence d'un virus. Chez les bovidés existe une maladie dénommée leucémie lymphoïde chronique bovine ou lymphocytose persistante, qui est provoquée par le BLV (Bovine Leukemia Virus). Cette maladie présente certaines caractéristiques phénotypiques similaires avec la LLC . Le BLV est un rétrovirus bêta appartenant à une famille de pathogènes responsables de pathologies malignes et neurologiques diverses dont les séquences sont apparentées au HTLV. Un autre argument indirect en faveur de l'existence d'une étiologie virale serait l'expression constitutive d'IL-10 par les lymphocytes B de la LLC et les cellules dendritiques dérivées des monocytes. Finalement, le défaut d'expression du récepteur B et sa rétention au niveau du Réticulum Endoplasmique est semblable à celui qui a été observé après transfection par la protéine K1 du virus HHV-8 dans une lignée de cellules B.

Notre objectif étant la mise au point d'approches moléculaires, afin de pouvoir cibler de manière préférentielle la présence de séquences virales exogènes au sein des cellules de patients affectés, nous avons utilisé une approche d'analyse soustractive (SSH), issue de la méthode RDA (Representational Difference Analysis). Cette approche peut permettre de déceler les différences d'expression entre cellules B leucémiques et B normales par enrichissement des séquences qui diffèrent, à l'aide des étapes d'amplification par PCR. Ainsi, on peut envisager de détecter d'une part des gènes dont l'expression diffère entre les cellules B pathologiques et B normales, d'autre part la présence éventuelle des séquences d'origine virale, sans connaissance préalable de leur nature, au sein des lymphocytes de patients leucémiques. Les résultats obtenus jusqu'à présent, n'ont pas encore confirmé la présence d'un virus dans l'étiologie de la LLC. Cependant nous avons détecté de nombreux gènes exprimés de manière différentielle et qui sont à l'étude actuellement. Pour la suite de ce projet, il serait intéressant de prendre en considération des phénotypes associés à une infection virale dans ces cellules et ainsi sélectionner le matériel biologique à soustraire parmi les individus susceptibles d'être porteurs d'un virus pathogène. Finalement, afin de pouvoir vérifier l'hypothèse d'une étiologie virale de la LLC nous proposons l'utilisation des micropuces d'ADN contenant des gènes des virus humains connus.

Les hybridations soustractives décrites ci-dessus représentent une méthodologie puissante applicable à des problèmes divers de la biologie. Ce type d'analyses peut permettre non seulement l'isolement d'un virus connu ou inconnu, mais a également le potentiel d'identifier des gènes dont l'expression diffère entre les cellules B pathologiques et B normales, ou entre cellules activées et non activées. Par contre, l'utilisation des micropuces d'ADN offre spécifiquement la possibilité d'identifier la présence de génomes viraux connus ou apparentés dans les cellules leucémiques, avec une grande sensibilité.

Le dérèglement du système immunitaire contribue à la survenue des nombreuses maladies telles que le cancer, les maladies infectieuses et les maladies auto-immunes. Un grand nombre de ces pathologies sont héréditaires et appartiennent aux maladies multifactorielles. Evie Melanitou, avec la participation de Sadrina Benabla, s'est intéressée à la génomique fonctionnelle dans l'étude de la réponse immune, dans un premier temps de l'autoimmunité, lors des étapes précoces d'inflammation, avant l'apparition des signes cliniques. Le but de ces études est de pouvoir déceler les premières étapes de la dérégulation du système immunitaire quant à la reconnaissance du soi d'une part, et la relation d'autre part, de ces mécanismes précoces avec la mise en place de "surveillance" immune visant au contrôle des infections et de la tumorigénèse.

Nous avons établi des sous phénotypes et démontré que ceux ci corrèlent avec les phases finales d'auto-immunité (Melanitou et al J Immunol 2004). Ceci nous a permis d'identifier des gènes impliqués dans les stades précoces d'autoimmunité, par une approche d'analyse fonctionnelle à haut débit à l'aide des puces à ADN. Ces gènes jouent un rôle dans le système immunitaire d'une part et dans le cycle cellulaire d'autre part. L'analyse des aspects fonctionnels de ces gènes, nous a permis de les classer en réseaux, et permet actuellement de conduire des études visant à la compréhension des étapes pré inflammatoires de maladies aussi variées que le cancer, l'autoimmunité et les maladies infectieuses. D'autre part, des infections virales nous serviront comme facteur initiateur exogène (effet de l'environnement) pouvant jouer un rôle dans le dérèglement du système immunitaire et influer sur la survenue de telles maladies.

Mots-clés: Autoimmunité, Leucémie Lymphoïde Chronique, Immunopathologie



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