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     Immunogénétique Cellulaire


  Responsable : THEZE Jacques (jtheze@pasteur.fr)


  resume

 

L'infection par le VIH conduit progressivement à un déficit immunitaire important. L'Unité analyse les bases moléculaires de ce dysfonctionnement. Dans le traitement de cette infection, en complément des AntiRétroViraux (ARV), l‘immunothérapie pourrait enrichir notre arsenal thérapeutique. Dans ce cadre, nous explorons le potentiel de l'interleukine-2 (IL-2) et de l'interleukine-7 (IL-7). Par ailleurs, au niveau biochimique, nous étudions le mécanisme d'action de l'IL-2 sur les différentes formes de récepteur exprimées par les sous-populations lymphocytaires.



  rapport

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1) Bases moléculaires du dysfonctionnement des lymphocytes T dans l'infection VIH (Florence Bugault, Stéphanie Beq, Olivier Juffroy, Jean-Louis Moreau et Jean-Hervé Colle en collaboration avec J.-F. Delfraissy, Centre Bicêtre, Assistance Publique-Hôpitaux de Paris)

Une réduction progressive du nombre des lymphocytes T CD4 domine la physiopathologie de l'infection VIH. De plus, l'étude de la réactivité des lymphocytes T révèle des anomalies fonctionnelles importantes. Afin de caractériser ces anomalies, nous explorons le rôle de l'IL-2 et de l'IL-7 dans différents groupes de patients séropositifs.

L'IL-2 est une lymphokine activatrice majeure du système immunitaire. L'analyse de l'expression des trois chaînes de son récepteur (RIL-2) et de la réactivité des sous-populations lymphocytaires nous ont conduit à identifier des dysfonctionnements importants du système IL-2/RIL-2 chez les patients VIH+. Plus récemment, au cours d'un suivi longitudinal d'un groupe de patients, nous avons analysé à partir de lymphocytes T CD8, les signaux de transduction de l'IL-2. Chez les patients virémiques, au début de l'étude, les lymphocytes CD8 purifiés sont incapables d'activer la voie de signalisation Jak/STAT. De façon intéressante, après six mois de traitement ARV nous avons observé une réversion de ce défaut de la voie Jak/STAT. Notre étude apporte donc de nouvelles données, sur la nature des anomalies moléculaires qui caractérisent les lymphocytes des patients VIH+.

L'IL-7 est une cytokine critique contrôlant à la fois la thymopoîèse et l'homéostasie des lymphocytes T périphérique. Nous avons étudié le système de l'IL-7 et de son récepteur chez les patients VIH+. Chez les patients virémiques, à côté d'anomalies de l'expression de la chaîne spécifique du récepteur de l'IL-7 ( R-IL-7 alpha), nous avons retrouvé une réduction significative de la prolifération induite par l'IL-7. De la même manière, l'induction de la molécule anti-apoptotique bcl-2 est diminuée ou abolie chez ces patients virémiques. Parallèlement, nous avons observé une correction importante de ces anomalies dans les groupes de patients recevant des ARV.

Nos résultats montrent l'existence d‘une atteinte du fonctionnement de plusieurs systèmes cytokiniques et de leurs voies de signalisation au cours de l'infection par le VIH. Au niveau moléculaire, les mécanismes susceptibles d'expliquer ces effets du virus restent l'objet de nombreuses études. La glycoprotéine d'enveloppe du VIH (gp120 ) retrouvée dans le sérum et les ganglions des patients séropositifs pourrait jouer un rôle dans ces altération. En effet, nous avons montré que gp120 en se liant à son récepteur, exerce un effet négatif sur la prolifération et la signalisation des lymphocytes CD4 provenant de sujets sains. De façon similaire, chez des patients virémiques, gp120 pourrait conduire à un blocage des voies Jak/STAT, partagées par l'IL-2 et l'IL-7.

2) Immunothérapie chez les patients VIH+ : potentiel thérapeutique de l'IL-2 et de l'IL-7 (Florence Bugault, Stéphanie Beq, Jean-Louis Moreau, et Jean-Hervé Colle. En collaboration avec J.-F. Delfraissy, Centre Bicêtre, Assistance Publique-Hôpitaux de Paris et M. Morre, Cytheris S.A. Vanves).

Le traitement des patients séropositifs, à partir d'un certain stade d'évolution de leur maladie, nécessite l'administration d'ARV. Pour une fraction importante des patients, ce type de traitement présente une efficacité avérée à la fois sur le contrôle de la charge virale et sur la restauration du compte des CD4. Cependant, le traitement n'entraîne pas l'éradication du virus et ne restaure pas de réponses anti-virales efficaces. De plus, les ARV doivent être pris à vie et leurs effets indésirables sont importants. La recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques reste un objectif prioritaire. L'utilisation complémentaire de cytokines comme l'IL-2 ou l'IL-7 ouvrent des perspectives pour de nouveaux traitements.

Plusieurs essais cliniques ont déjà été réalisés en utilisant de l'IL-2 chez des patients traités par des ARV. Ces essais démontrent la capacité de l'IL-2 à augmenter de façon durable le compte des CD4 tout particulièrement ceux de phénotypes naïfs. Notre laboratoire a réalisé un essai de ce type avec un groupe de patients qui, sous ARV, restaient avec un taux faible de CD4 (< 200 cellules /mm3 malgré un bon contrôle de la charge virale. Au cours de cet essai, nous avons observé que l‘IL-2 faisait apparaître une nouvelle sous-population lymphocytaire CD4+ /CD25+. L'apparition de cette nouvelle population lymphocytaire semble un effet majeur du traitement IL-2 comme l'a suggéré C. Lane NIH, USA. Les mécanismes par lesquels l'IL-2 permet l'émergence de cette sous-population restent à préciser. Dans une étude récente nous avons montré que l'IL-2 induisait rapidement une élévation du taux plasmatique de deux cytokines thymopoïétiques, l'IL-7 et Flt-3L. Ceci suggère qu'au cours de l'immunothérapie, l'IL-2 suscite une production de lymphocytes au niveau central. Nous poursuivons la caractérisation de cette sous-population lymphocytaire CD4+/CD25+ dans le cadre du GPH VIH/SIDA (voir ci-dessous)

Compte tenu de ses propriétés lymphopoïétiques, l'IL-7 a un potentiel thérapeutique important. En effet, chez des patients immunodéficients, elle devrait être susceptible d'élargir le répertoire et d'augmenter les réponses spécifiques des lymphocytes T. Dans un groupe de patients VIH+, nous avons suivi de manière longitudinale le taux d'IL-7 plasmatique, avant et pendant un traitement par des ARV. Une corrélation positive a été démontrée entre le taux d'IL-7 précédent le traitement et le niveau de restauration des CD4 au cours du traitement. Ceci suggère une implication de l'IL-7 dans le contrôle du pool des CD4 chez les patients séropositifs. Cette étude indique aussi que sous ARV, un traitement par l'IL-7 devrait favoriser la restauration des CD4. Dans ce cadre, une étude pré clinique de l'IL-7 est en cours. La réponse à l'IL-7 étant en partie réglée par la modulation négative de son récepteur, ce mode de régulation et sa réversibilité sont à l'étude de manière à mieux anticiper les conséquences de son administration in vivo. De plus, nous avons vérifié que les ARV n'altèrent pas le fonctionnement normal du RIL-7. Ce travail est mené de manière complémentaire à celui de N. Israêl et F. Barré Sinoussi (Unité de Biologie des Rétrovirus, Institut Pasteur).

3) Récepteur de l'IL-2 : mise en évidence d'une nouvelle forme, mécanismes de transduction du signal et réponses différentielles des sous-populations lymphocytaires (Virginie Mazard-Pasquier, Jean-Louis Moreau et Thierry Rose)

Trois chaînes alpha, beta et gamma peuvent rentrer dans la composition du récepteur de l'IL-2 (RIL-2). Le niveau d'expression de chacune de ces chaînes dépend du sous-type de lymphocytes. Deux formes fonctionnelles du RIL-2 ont déjà été décrites : l'assemblage des trois chaînes produit un récepteur de très haute affinité (Kd = 10pM) alors que les deux chaînes beta et gamma composent un récepteur de moindre affinité (Kd = 1nM). Nos résultats récents suggèrent l'existence d'une troisième forme du RIL-2, composée de deux chaînes beta. La construction puis l'expression de chaînes beta hybrides, porteuses d'epitopes HA ou Myc, nous ont permis de démontrer l'existence des dimères beta/beta par co-immunoprecipitation. De même, l'expression de chaînes beta hybrides, fusionnées avec les protéines fluorescentes dérivées de la GFP (beta-CFP ou beta-YFP) nous ont permis d'identifier les dimères de beta/beta à la surface de lignées cellulaires transfectées COS et HEK. Par microscopie confocale, nous avons mesuré la fluorescence résultant du transfert d'énergie (FRET) d'une sous unité à l'autre après irradiation. Parallèlement, les associations beta/gamma et beta/beta ont été modélisées avec ou sans IL-2. Nous utilisons ces modèles moléculaires pour prédire les contacts clés dans la reconnaissance et l'association des différentes chaînes du système RIL-2.

Les lymphocytes NK répondent à l'IL-2 spontanément et de manière très intense. Comme ces cellules expriment à leur surface beaucoup de chaînes beta et peu de gamma, nous supposons que les dimères beta y jouent un rôle physiologique. Afin de vérifier si ce récepteur beta/beta allume une voie spécifique, nous explorons les diverses alternatives de la voie Jak/STAT à partir de lymphocytes NK humains purifiés (en collaboration avec S. Pellegrini).

A la différence des cellules NK, pour répondre à l'IL-2, les lymphocytes T ont besoin d'être co-activés par un signal provenant de leur récepteur spécifique (TCR). Le rôle de cette co-activation n'est pas encore compris. Elle pourrait conditionner l'expression du RIL-2 de haute affinité ou agir sur les mécanismes contrôlant l'activation ou la division cellulaire nécessaires à la réponse IL-2. Pour trancher entre ces deux types d'hypothèses, nous avons étudié des souris transgéniques exprimant de manière constitutive la chaîne RIL-2beta humaine. Leurs lymphocytes CD4 répondent à l'IL-2 par la phosphorylation des STATs et des MAPKs. Cependant, ils ne prolifèrent pas car l'inhibiteur de la division cellulaire p27kipl reste exprimé à un niveau élevé après exposition à l'IL-2. La prolifération à l'IL-2 de ces lymphocytes n'est acquise qu'après répression de p27kipl obtenue après stimulation du TCR. Au contraire, chez les lymphocytes CD8 de souris transgéniques l'inhibition directe de l'expression de p27kipl sous l'influence de l'IL-2 permet une réponse de ces cellules en l'absence de co-stimulation par le TCR. L'expression du RIL-2 est donc suffisante pour déterminer la capacité des lymphocytes T cytotoxiques à répondre à l'IL-2. Par contre, pour les lymphocytes CD4, cette compétence n'est acquise qu'après engagement du récepteur spécifique d'antigène (en collaboration avec F. Gesbert).

4) Grand Programme Horizontal VIH/SIDA : "Gene expression and signaling defects in the pathogenesis of HIV infection"

Sept unités pasteuriennes, appartenant à quatre départements, sont impliquées dans ce projet comprenant trois sous-programmes. Ce GPH vise à analyser, au niveau des lymphocytes CD4, les gènes et les signaux de transduction impliqués dans lé résistance ou l'évolution vers le SIDA. Il vise aussi à caractériser le mécanisme d'action de l'IL-2 in vivo. Il est piloté par un comité comprenant M. Muller-Trutwin, O. Acuto, L. Rogge, F. Arenzana-Seisdedos. La coordination de l'ensemble est assurée par Jacques Thèze. Notre Unité est directement impliquée dans deux sous-programmes. Avec l'Unité d'Immunologie Moléculaire (O. Acuto) nous étudions les lymphocytes CD4 de patients infectés, contrôlant spontanément leurs charges virales, récemment caractérisés par J.-F. Delfraissy (patients " HIV Controllers "). Ces études sont effectuées par S. Potter (boursier du gouvernement australien). Avec le laboratoire d'Immunorégulation (L. Rogge) l'exploration du mécanisme de restauration des CD4 après traietement par ARV plus IL-2 a été entreprise en combinant une caractérisation de la population CD4+ /CD25+ purifiée avec une étude de génétique fonctionnelle. Les patients proviennent de l'essai ANRS 118 (Pr Y. Levy)

Mots-clés: HIV, lymphocytes CD4, IL-2, RIL-2, IL-7, RIL-7, récepteurs et signaux de transduction, immunothérapie



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  MERLO Elise (emerlo@pasteur.fr) COLLE Jean-Hervé. I.P. (jhcolle@pasteur.fr)

GUEZ Valérie. I.P. (vguez@pasteur.fr)

ROSE Thierry. I.P. (rose@pasteur.fr)

THEZE Jacques I.P. (jtheze@pasteur.fr)

BEQ Stéphanie (Doc-3) sbeq@pasteur.fr

PASQUIER Virginie (Postdoc) vmazard@pasteur.fr

JUFFROY Olivier (Doc-1) juffroy@pasteur.fr

POTTER Simon (Postdoc) potter@pasteur.fr

BUGAULT Florence (Ingénieur) fbugault@pasteur.fr

MOREAU Jean-Louis (Ingénieur) jlmoreau@pasteur.fr


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