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     Intéractions Bactéries- Cellules


  Responsable : Cossart Pascale (pcossart@pasteur.fr)


  resume

 

Notre Unité étudie les bases moléculaires et cellulaires du pouvoir pathogène de Listeria monocytogenes, un modèle pour l'étude du parasitisme intracellulaire. L. monocytogenes est responsable d'infections alimentaires graves dont le taux de mortalité est de 30 %. Cette bactérie se caractérise par sa capacité à traverser les barrières intestinale, hémato-encéphalique ou fœto-placentaire et à envahir de nombreux types de cellules dans lesquelles elle se multiplie. De plus, L. monocytogenes se déplace dans le cytosol des cellules infectées et passe de cellule en cellule en utilisant un mode de propulsion original: la polymérisation de l'actine cellulaire. En 2004, notre activité a porté sur l'étude des composants bactériens et cellulaires permettant l'invasion cellulaire, l'identification de nouveaux gènes de virulence, la régulation de l'expression de ces gènes et l'analyse des mécanismes de la traversée des barrières de l'hôte. Parallèlement, nous avons poursuivi l'étude de la motilité actine-dépendante d'une autre bactérie intracellulaire, Rickettsia conorii, et l'analyse de son mécanisme d'entrée dans les cellules.



  rapport

cale

I. Entrée de L. monocytogenes dans les cellules épithéliales:

Rôle des internalines InlA et InlB, deux protéines bactériennes impliquées dans l'entrée

InlA et son récepteur la E-cadhérine (D. Cabanes, M. Lecuit, S. Sousa).

Nous avons poursuivi la caractérisation de la voie d'entrée InlA-dépendante en aval de l'interaction avec la E-cadherine. Outre les caténines, l'intervention du complexe Arp2/3, des Rho-GTPases, de la myosine VIIa non conventionnelle et de la vézatine ont été démontrées. Le rôle d'un nouveau ligand de l'α-caténine, impliqué dans ce processus, est en cours de caractérisation (Photo 1).

InlB et ses récepteurs Met et gC1q-R (H. Bierne, N. Khelef, M. Lecuit)

InlB interagit avec Met le récepteur du facteur de croissance HGF et gC1q-R, un récepteur du composant du complément C1q. Nous poursuivons l'étude de la signalisation activée lors de l'entrée InlB-dépendante en aval de Met. Nous avons montré que, outre le complexe Arp 2/3 et le couple cofiline-LIM-kinase, les GTPases Rac et Cdc42, les molécules WAVE, N-WASP, Abi1 et ENA/VASP sont aussi impliquées dans la formation de la coupe de phagocytose (Photo 2). Nous avons aussi montré que gC1qR est important pour l'entrée InlB-dépendante, mais requiert l'activité de Met. Parallèlement, nous avons étudié le rôle de InlB in vivo et démontré l'existence d'une spécificité d'espèce de l'interaction InlB-Met.

Autres mécanismes impliqués dans l'entrée (S. Dupuis, J. Pizarro-Cerda, S. Seveau, E. Veiga)

Nous avons démontré que les deux voies d'entrée InlA- et InlB-dépendantes requièrent l'intégrité des rafts, au niveau du recrutement de la E-cadherine pour InlA et à des étapes plus tardives que l'interaction avec Met pour InlB. Parallèlement, nous avons mis en évidence le rôle de la PI 4-kinase dans l'entrée de L. monocytogenes et celui du PI4P dans le recrutement de la molécule adaptatrice AP1 au site d'entrée. Nous avons aussi découvert que la septine 9, une GTPase capable de former des filaments colocalisant avec l'actine filamenteuse et les microtubules, est recrutée par L. monocytogenes lors de l'invasion et qu'elle semble contribuer à la sortie de la vacuole de phagocytose. Enfin, nous avons montré que l'ubiquitination de Met et son endocytose, induites par l'interaction avec InlB, régulent l'entrée de L. monocytogenes dans les cellules.

II. Identification de nouveaux mécanismes de virulence de L. monocytogenes

De nouveaux facteurs de virulence ont été identifiés par mutagenèse aléatoire ou par une approche post-génomique:

Bsh (O. Dussurget), une hydrolase des sels biliaires qui favorise la résistance des bactéries à la bile et leur persistance dans la lumière intestinale

Auto (D. Cabanes), une autolysine facilitant l'entrée dans les cellules, essentielle pour plusieurs étapes de l'infection

FbpA (D. Cabanes, S. Dramsi), une protéine de surface, secrétée par le système de sécrétion SecA2, qui lie la fibronectine, permet l'adhésion des bactéries aux cellules et qui régule la production d'autres facteurs de virulence, la listeriolysine et InlB, vraisemblablement en agissant comme une chaperonne

Stp (C. Archambaud, O. Dussurget), une sérine/thréonine phosphatase impliquée dans la virulence qui a pour cible le facteur d'élongation EF-Tu et contrôle son activité

Deux sortases (H. Bierne, C. Sabet), qui ancrent des protéines de surface via le motif LPXTG (sortase A) ou NXXTX (sortase B). L'inactivation de la sortase A abolit l'ancrage des protéines LPXTG et atténue la virulence. L'inactivation de la sortase B n'affecte pas la virulence. Sa contribution précise est en cours d'étude

III. Régulation de l'expression des gènes de virulence de Listeria monocytogenes

Etude du régulon VirR/VirS (P. Mandin). Le système à deux composants VirR/VirS a été mis en évidence par STM. L'analyse transcriptomique de VirR/VirS a montré qu'il régule de nombreux gènes, dont certains sont impliqués dans la synthèse ou la modification de composants de surface, démontrant le rôle essentiels de ces composants dans le processus infectieux.

Recherche de petits ARNs non codants régulateurs (P. Mandin, F. Repoila). Plusieurs approches sont en cours pour identifier des petits ARNs qui seraient impliqués dans la virulence, parmi lesquelles l'analyse de membranes portant des séquences intergéniques et la co-immunoprécipitation à l'aide d'anticorps spécifiques de Hfq, une protéine liant les petits ARNs que nous venons de produire (Collaboration avec J. Johansson).

IV. Epidémiologie, physiopathologie de l'infection et réponses de l'hôte à L. monocytogenes

Rôle de InlA dans la traversée des barrières de l'hôte (E. Huillet, M. Lecuit)

Une étude épidémiologique a montré que 96% des souches cliniques et seulement 65% des souches alimentaires expriment une protéine InlA fonctionnelle (collaboration avec C. Jacquet, Centre de Référence des Listeria). La totalité des souches responsables d'infections materno-fœtales expriment une protéine InlA fonctionnelle, suggérant l'implication de InlA dans la traversée de la barrière foeto-placentaire. Une étude histologique de placentas de patientes atteintes de listériose et l'analyse de l'invasion bactérienne de trophoblastes en culture ou issus d'explants a confirmé cette hypothèse.

Comme InlA reconnaît la E-cadhérine humaine et non celle de souris, nous générons des souris transgéniques exprimant la E-cadhérine humaine en lieu et place de la E-cadhérine murine pour évaluer la contribution de InlA dans la traversée des autres barrières de l'hôte (Collaboration avec C. Babinet, Unité de Biologie du développement, Institut Pasteur).

Réponses de l'hôte à l'infection par L. monocytogenes (O. Dussurget, M. Lecuit)

Nous avons entrepris une analyse globale de la réponse de l'hôte à l'infection par une approche transcriptomique (Collaborations avec J.I. Gordon, Université de Washington, St Louis, MO, et P. Ricciardi-Castagnoli, Université de Milano-Bicocca, Italie). Nous étudions la réponse intestinale de souris axéniques exprimant la E-cadhérine humaine au niveau intestinal et celle des cellules intestinales et dendritiques en culture. La comparaison des profils d'expression génique induits par les souches sauvage et mutantes de L. monocytogenes est en cours d'analyse.

Analyse en temps réel de la listériose murine (O. Dussurget)

Nous avons entrepris l'étude de l'infection par L. monocytogenes en temps réel par une technique non invasive d'imagerie basée sur la bioluminescence (Collaboration avec J. Hardy et C. Contag de l'Université de Stanford, CA) qui devrait nous permettre de réaliser une analyse spatio-temporelle complète de la progression de la listériose murine.

V. Rickettsia conorii: Un autre modèle pour l'étude des mouvements dépendant de l'actine et de l'entrée dans les cellules épithéliales (E. Gouin, J. Martinez, V. Villiers)

Comme L. monocytogenes, Rickettsia conorii, possède une motilité dépendante de la polymérisation de l'actine. Les filaments d'actine polymérisée par R. conorii sont longs, non branchés, fixés sur la bactérie. Nous avons identifié un gène rickA présent chez R. conorii et absent chez Rickettsia prowazekii, qui ne polymérise pas l'actine. La protéine RickA active directement et sans doute de façon transitoire le complexe Arp2/3, induisant la formation de longs filaments d'actine. Nous avons montré que l'entrée de R. conorii est aussi dépendante du complexe Arp2/3 et que ce processus est régulé par Cdc42, la PI 3-kinase, c-Src et la cortactine.

Légendes des photos :

Photo 1. Schéma des facteurs et évènements impliqués dans l'entrée InlA-dépendante.

Photo 2. Schéma des facteurs et évènements impliqués dans l'entrée InlB-dépendante.

Mots-clés: bactéries, virulence, biologie cellulaire, régulation, mutagenèse



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Alexandra Joubert, Institut Pasteur, Secrétaire, ajoubert@pasteur.fr Cossart, Pascale, Institut Pasteur, Professeur, Chef d’Unité, pcossart@pasteur.fr

Dussurget, Olivier, Institut Pasteur, Chargé de Recherches, odussur@pasteur.fr

Khelef, Nadia, Institut Pasteur, Chargée de Recherches, nkhelef@pasteur.fr

Pizarro-Cerda, Javier, Institut Pasteur, Chargé de Recherches, pizarroj@pasteur.fr

Bierne, Hélène, INRA, Chargée de Recherches, hbierne@pasteur.fr

Huillet, Eugénie, INRA, Chargée de Recherches, eugenieh@pasteur.fr

Repoila, Francis, INRA, Chargé de Recherches, frepoila@pasteur.fr

Cabanes, Didier, Stagiaire post-doctorant IP/CEE, dcabanes@pasteur.fr

Dupuis,Stéphanie, Stagiaire post-doctorante Ligue contre le Cancer, sdupuis@pasteur.fr

Lecuit, Marc, Chef de clinique Hopital Necker, Paris, mlecuit@pasteur.fr

Martinez, Juan, Stagiaire post doctorant FRM, jmartine@pasteur.fr

Seveau, Stéphanie, Stagiaire post doctorante Pasteur, sseveau@pasteur.fr

Archambaud, Cristel, Doctorante, Boursière du Ministère de la Recherche, carcham@pasteur.fr

Mandin, Pierre, Doctorant Boursier du Ministère de la Recherche, pmandin@pasteur.fr

Sousa, Sandra, Doctorante, Boursière de la Fundaçao para a Ciencia e Tecnologia, ssousa@pasteur.fr

Sabet, Christophe, Doctorant Boursier du Ministère de la Recherche, csabet@pasteur.fr

Veiga, Esteban, Stagiaire post doctorant EMBO eveiga@pasteur.fr

Gouin Edith, Institut Pasteur, Ingénieur, egouin@pasteur.fr

Tham, To Nam, Institut Pasteur, Ingénieur, ttham@pasteur.fr

Villiers Véronique, Institut Pasteur, Technicienne, vvilliers@pasteur.fr


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