Portail IP   bandeau_genéral
imprimer
Imprimer
     Hépatites - laboratoire mixte Necker-Institut Pasteur


  Responsable : Christian Bréchot, Valérie Thiers (brechot @necker.fr, vthiers@pasteur.fr)


  resume

 

Les travaux de notre laboratoire et du Centre National de Référence sur les Hépatites virales B et C, sont centrés sur la mise en place de nouvelles approches méthodologiques pour l'analyse des infections par les virus des hépatites B (VHB) et C (VHC). Les virus B et C représentent en Europe les principaux agents impliqués dans la survenue du carcinome hepatocellulaire (CHC). En étroite collaboration avec l'unité mixte Inserm 370/Pasteur, nous développons un projet ayant pour objectif d'étudier à partir de cellules hépatocytaires isolées par microdissection laser chez des sujets ayant développé un CHC sur cirrhose virale C, la variabilité intra-hépatique de la capside du VHC et le protéome de ces cellules hépatocytaires, afin d'identifier de nouveaux marqueurs biologiques du CHC. Parallèlement, le Centre de Référence contribue à la surveillance moléculaire et à l'identification des risques résiduels de transmission de ces virus.



  rapport

cale

Le VHC est un des facteurs important influençant la survenue du carcinome hépatocellulaire (CHC). L'identification des gènes dont l'expression est modulée lors des différentes étapes de l'infection chronique par le VHC, est essentielle pour la compréhension des mécanismes conduisant à terme au développement d'un CHC et pour l'identification de nouveaux marqueurs diagnostiques et/ou pronostiques.

Le foie est un tissu hétérogène dont l'architecture est profondément modifiée au cours de ce processus pathologique. C'est pourquoi, les études réalisées à partir de fragments hépatiques totaux pathologiques ne reflètent pas spécifiquement le profil d'expression des cellules hépatocytaires. La microdissection laser permet d'isoler à partir d'un fragment hépatique, des groupes d'hépatocytes parfaitement caractérisés. Notre projet a pour objectif d'associer les techniques de microdissection laser sur des fragments hépatiques de CHC lié au VHC pour deux types d'études : (1) l'analyse de la variabilité intra-hépatique de la capside du VHC et (2) l'analyse des modifications du protéome hépatocytaire.

1 Etude des variants de la capside du VHC, protéine virale potentiellement impliquée dans la carcinogenèse (R. SOBESKY, N. DERIAN, V. THIERS).

La capside, protéine de structure du virus de l'hépatite C (VHC) module l'expression de plusieurs gènes cellulaires, avec un effet sur la prolifération et la viabilité cellulaire. Des travaux réalisés au laboratoire, sur un petit nombre de cas (n=4), ont montré que des protéines de capside, isolées à partir de cellules tumorales, différant de quelques acides aminés de celles isolées de la non-tumeur, présentaient des effets biologiques différents sur certaines voie de signalisation cellulaire (Delhem et al, 2001, Oncogene ; Pavio et al., manuscrit en révision). Ces travaux suggèrent l'existence d'une distribution des quasi-espèces différentes dans la tumeur, ouvrant la possibilité d'une sélection de souches ayant des propriétés fonctionnelles modifiées. Par conséquent, la mise en évidence chez d'autres sujets atteints de CHC, de quasi-espèces portant des propriétés similaires, apporterait des données en faveur d'une sélection de variants viraux au cours de l'infection chronique. Notre projet repose sur l'identification " in situ " de séquences de capside du VHC issues de groupes d'hépatocytes tumoraux et non tumoraux isolés par microdissection laser dans des CHC. Nous avons sélectionné pour cette étude 12 patients infectés par le génotype 1b du VHC, porteurs de CHC. Des groupes d'environ 2000 hépatocytes adjacents isolés par microdissection laser dans la zone tumorale (T) et de deux nodules cirrhotiques (NT1, NT2) ont été analysés pour 7 patients. La comparaison des séquences obtenues pour chaque patient a montré une hétérogénéité de la protéine capside chez 6/7 patients, qui se situait soit entre les différents nodules cirrhotiques, soit entre les nodules cirrhotiques et la zone tumorale. L'impact biologique de ces quelques mutations reste à déterminer. Les séquences majoritaires de la protéine Core, issues des nodules cirrhotiques et de la zone tumorale seront testées pour leur effet biologique sur certaines voies de signalisation cellulaire. Ces premiers résultats obtenus grâce à l'association de la microdissection laser et de la RT-PCR nous ont permis d'isoler des séquences complètes du gène de la capside du VHC à partir d'un nombre limité d'hépatocytes.

2 Analyse du protéome de patients infectés par le VHC atteints de CHC à partir d'hépatocytes isolés par microdissection (A. DOS SANTOS, F. DEMAUGRE & V THIERS)

Notre projet est centré sur l'étude comparative des protéomes d'hépatocytes tumoraux et non-tumoraux isolés par microdissection laser, à partir de coupes histologiques congelées. L'approche repose sur l'association de l'électrophorèse bi-dimentionnelle (2D-PAGE) et de la spectrométrie de masse pour identifier les protéines différentiellement exprimées dans le CHC lié au VHC (projet ARECA - ARC/Inserm).

Les fragments tissulaires inclus dans cette étude ont été obtenus de la Collection Nationale des hépatocarcinomes (subventionnée par l'Inserm/DHOS). Pour déterminer les conséquences de la microdissection laser sur l'établissement du profil d'expression différentiel, nous avons comparé les profils protéiques des zones tumorale (T) et non tumorale (NT) réalisés à partir de cellules microdisséquées et de lames entières. L'analyse bioinformatique des gels réalisés en triple, nous a permis de déterminer le profil d'expression différentiel de chacune des conditions étudiées. Les protéines identifiées comme différentiellement exprimées (test de Student non appareillé p?0,05 et rapport d'expression ? 2) sont en cours d'identification par spectrométrie de masse (MALDI-TOF ; collaboration avec l'unité Inserm U467). Nous avons examiné les variations relatives d'expression de 30 protéines différentiellement exprimées. Globalement, les rapports d'expression entre la zone T et NT étaient plus élevés pour les cellules microdisséquées par comparaison à ceux observés pour les lames entières. De plus, pour 8 protéines, une expression différentielle entre la T et la NT n'a été observée que pour les extraits protéiques issus des cellules microdiséquées. Ces observations suggèrent que la microdissection permet de circonvenir l'hétérogénéité cellulaire du foie cirrhotique et apporte un réel enrichissement des protéines d'intérêt. Ces données valident le choix de la microdissection dans notre étude et démontrent sa faisabilité.

3 Activité du CNR Hepatites virales B et C (F. RIMLINGER, V. THIERS)

Les projets de recherche du laboratoire mixte sont également associés aux activités menées par le CNR. Les données moléculaires, par le biais d'analyses phylogénétique, sont utilisées pour " tracer " l'origine de certaines infections virales et permettent d'affirmer ou d'infirmer des hypothèses concernant les modes de transmission. Des études visant à l'analyse des modes résiduels de transmission des VHB et VHC sont en cours : Investigation d'épisodes de transmission nosocomiale en collaboration avec l'Institut de Veille Sanitaire ; étude de l'épidémiologie moléculaire du virus de l'hépatite C dans des zones géographiques diverses en collaboration avec le réseau HEPMED (projet CEE coordonné par B. Larouzé) et le réseau des Instituts Pasteur (PTR coordonné par Pénélope Mavromara, IP de Grèce) et de l'hépatite B en Tunisie, (IP Tunis, P. H. Triki).

Mots-clés: Epidémiologie moléculaire, VIRUS DE L’HEPATITE C (VHC), CARCINOME HEPATOCELLULAIRE (CHC), MICRODISSECTION LASER, VARIABILITE GENETIQUE, PROTEOME, ELECTROPHORESE BIMENTIONNELLE (2D-PAGE)



  publications

puce Toutes les publications 2004 sur notre base de données


  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  APRILE France, Inserm, aprile@necker.fr BRECHOT Christian, PUPH INSERM, brechot@necker.fr SOBESKY Rodolphe, Médecin, étudiant en thèse

DERIAN Nicolas étudiant Master

THIERS Valérie, Ingénieur, vthiers@pasteur.fr

RIMLINGER François, Technicien, frimling@pasteur.fr

DOS SANTOS Alexandre , Technicien, ads@pasteur.fr


Rapports d'activité 2004 - Institut Pasteur
filet

Debut de Page recherche Portail Institut Pasteur

En cas de problèmes, de remarques, ou de questions concernant cette page Web écrire à rescom@pasteur.fr