Notre objectif est d'étudier l'interaction du virus de l'hépatite C (VHC) avec sa cellule-cible et avec d'autres composants de l'hôte (lipoprotéines, immunoglobulines) ainsi que d'analyser l'impact de ces interactions sur la réponse immune. En l'absence de modèles cellulaires efficaces d'infection par le VHC, nous élaborons une stratégie de purification d'hématocytes humains infectés par le VHC ex vivo. D'autre part, nous étudions la structure et la composition des formes virales circulantes dans le séum de sujets infectés par le VHC et analysons le mécanisme d'infection de la cellule par ce virus. En utilisant un modèle rélicon du VHC, nous analysons les mécanismes d'inhibition de la réponse immune innée par le VHC et évaluons différentes possibilités pour la restaurer.

STRATEGIE DE PURIFICATION DES HEPATOCYTES INFECTES PAR LE VHC

Adrien Breiman, Catherine Ottone, Aurélie Verslype, Eliane Meurs 

(collaboration avec Patrick Maurel- INSERM U128, Montpellier, Gilles Duverlie, CHU-Faculté de Médecine, Amiens; Czeslaw Wychowski ; CNRS-FRE 2369 ; IP Lille, ; Pierre Charneau, IP, Paris ; Serban Morosan, INSERM 370 ; Faculté de Médecine Necker, Paris,)

Nous avons construit deux outils moléculaires destinés à ne s'activer que dans les cellules infectées par le VHC. L'un est un facteur de transcription fusionné avec une protéine résidente du réticulum endoplasmique via un motif de coupure par la protéase virale NS3/4A, l'autre est un gène codant pour une protéine de surface sous contrôle d'un promoteur activé par le facteur de transcription libéré par NS3/4A. En utilisant le modèle cellulaire du réplicon (Fig.1) , nous avons montré la spécificité de l'activation de ces deux outils. Ils ont été ensuite transferés dans des vecteurs lentiviraux pseudotypés et introduits dans des cultures primaires d'hépatocytes humains par voie de transduction. Ces cultures peuvent être infectées par incubation avec des sérums de patients VHC et la capacité de réplication du VHC y est déterminée par analyse RT-PCR en temps réel de son brin négatif d'ARN. Par RT-PCR en temps réel également, nous avons montré que l'infection par le VHC était capable d'induire la transcription de la protéine de surface, de façon spécifique. La purification des hépatocytes infectés par le VHC sera effectuée par tri immunomagnétique à l'aide d'anticorps dirigés contre la protéine de surface. L'analyse du transcriptome des hépatocytes infectés permettra de déterminer les voies métaboliques qui sont affectées aux temps précoces de l'infection.

Breiman,A., Molina,S, Pichard, L, Ottone,C., Charneau,P., Duverlie, G., Wychowski, C., Fournier,C., Maurel, P. and Meurs, E.F An HCV NS3/4A protease-dependent strategy for the identification and purification of Hepatitis C Virus-infected primary human hepatocytes. 10^th International Symposium on hepatitis C virus and related viruses , December 2-6, 2003. Kyoto, Japan

ETUDE DU MECANISME D'ENTREE DU VHC DANS LA CELLULE ET DE SON Interaction avec le récepteur " scavenger " type B classe 1 (SRB1/Cla-1)

Patrick Maillard, Ursula Andréo, Agata Budkowska

(Collaborations : Therry Huby et John Chapman, U 551 Inserm Hôpital de la Pîtié, Paris)

Plusieurs candidats-récepteurs pour le VHC ont été décrits sur la base de leur réactivité avec la protéine d'enveloppe E2. Néanmoins le VHC circulant dans le sérum de sujets infectés est associé aux lipoprotéines, et pourrait donc utiliser les récepteurs aux lipoprotéines pour infecter la cellule cible. Nous avons transfecté la lignée cellulaire CHO, qui n'exprime aucun des candidats récepteurs du VHC, avec le gène humain codant hSR-BI, un récepteur aux lipoprotéines (HDL, LDL, VLDL). Ce  système expérimental nous a permis de mettre en évidence la capacité du VHC provenant de sérums de patients à interagir avec le récepteur hSR-BI. Cette interaction est dépendante des lipoprotéines plasmatiques associées aux virus. La fonction de hSR-BI sur les cellules hépatiques humaines est en cours d'étude ainsi que le rôle de différentes classes de lipoprotéines dans l'entrée du VHC dans la cellule cible.

P. Maillard, T. Huby, U. Andreo, M. Moreau, J. Chapman, and A. Budkowska. The human scavenger receptor SR-BI/CLA 1 mediates binding and internalisation of natural hepatitis C virus into cells.11^th International Symposium on hepatitis C virus and related viruses , October 3-7, 2004. Heidelberg, Germany.

ETUDE DE La nucleocapside du VHC et DE son role dans la pathogenese de l'infection

Patrick Maillard, Farzin Roohvand, Ursula Andréo, Agata Budkowska

(Collaborations : K .Krawczynski, Hepatitis Branch CDC Atlanta Jean -Luc Teillaud Inserm U255, Paris, Jean Pierre Lavergne, IBCP, Lyon)

Les populations virales circulant dans le sérum de sujets infectés par le VHC restent mal définies et le virion infectieux n'a pas encore été isolé ni caractérisé. Nous avons montré que les nucléocapsides virales non-enveloppées du VHC sont présentes dans le sérum de sujets infectés par ce virus (Maillard et al. J. Virol 2001). (Fig.2) . Les nucléocapsides isolées à partir de sérum de sujets infectés ont une structure et des propriétés similaires à celles des particules " nucleocapside-like " produites dans les cellules d'insectes infectées par un baculovirus recombinant. Les anticorps monoclonaux induits par immunisation avec ces particules virales, nous ont permis de détecter la protéine de la capside dans les hépatocytes de chimpanzé au cours de l'infection expérimentale par le VHC (coll avec CDC, Atlanta) (Fig.3).

La production des nucléocapsides non-enveloppées et leur libération à partir des hépatocytes infectés pourrait être un moyen non-conventionnel d'échapper à la réponse immune de l'hôte, et d'induire de multiples effets immunopathologiques dans l'organisme infecté. En effet, les nucléocapsides du VHC, mise à part leur réactivité avec des anticorps spécifiques, ont la capacité de réagir avec le fragment Fcgdes IgG " non-immunes ". Le site " Fcγ receptor-like " formé par la protéine de la capside du VHC mime le récepteur Fcγ humain " néonatal " (FcRn). Les études par SPR (surface plasmon resonans) ont suggéré que la protéine de la capside pourrait fixer un anticorps anti-capside par " bipolar bridging " : par son paratope sur l'épitope viral et par son domaine Fcγ sur le motif FcγR (Fig.4). D'autres virus humains (CMV, HSV-1 EBV) codent également pour des protéines présentant les propriétés fonctionnelles des Fcγ Rs humains. Celles-ci leur permettraient d'éviter les conséquences effectrices des anticorps. La fonction  Fcγ R-  de la nucléocapside virale pourrait offrir au VHC la possibilité d'échapper aux mécanismes de défenses immunitaires médiés par le domaine Fcγ des anticorps anti-capside et/ou d'affecter les fonctions de récepteur FcRn au cours de l'infection par le VHC. Les travaux en cours portent sur l'interaction de la nucléocapside et de la protéin de la capside avec les cellules hépatiques et endothéliales humaines.

1. Maillard, J-P. Lavrgne, S. Siberil , G. Faure, F. Roohvand S. Petres , J-L. Teillaud and A. Budkowska Fcg receptor-like activity of Hepatitis C virus core protein" J. Biol. Chem. 279, 2340, 2347, 2004 .

3.Roohvand,F., U. Andreo , M. Flamand , J.P. Lavergne, and A. Budkowska. Interaction of HCV core protein with hepatic and endothelial cells.11th International Symposium on hepatitis C virus and related viruses , October 3-7, 2004.  Heidelberg, Germany.

INTERACTION DU VHC AVEC LA REPONSE IMMUNE INNEE

Adrien Breiman, Catherine Ottone, Rachel Couderc, Romain Pierlot, Florence Bayard, Eliane Meurs 

(Collaboration avec John Hiscott ; Lady Davis Institute ; Montréal, Can)

L'Interféron-α/α (IFN-α/α) est l'un des éléments importants de la réponse immune innée qui est déclenchée en réponse à différents pathogènes bactériens ou viraux et est essentielle pour une limitation rapide de la propagation ou de l'action de ces pathogènes. L'IFN exerce un effet antiviral direct sur les cellules en y induisant différents gènes par la voie de signalisation JAK/STAT. Il joue également un rôle important dans la maturation et l'activation des cellules dendritiques et en reliant la réponse immune innée à la réponse immune adaptative. A l'instar d'autres virus (virus de l'Influenza, de la Vaccine, de l'Ebola, Papillomavirus), le virus de l'Hépatite C a la capacité d'inhiber les évènements précoces de l'induction de l'IFN, en inhibant la phosphorylation de la protéine IRF3, un facteur de transcription essentiel pour la première phase d'induction des IFNs et capable également d'induire l'expression d'autres gènes impliqués dans la réponse antivirale. Le VHC serait ainsi capable d'affaiblir la réponse immune de l'hôte et de favoriser l'établisssement chronique de son infection. L'inhibition est effectuée par sa protéine non structurale NS3/4A. L'identification récente de TBK-1 et IKK comme les kinases responsables de la phosphorylation de IRF3 et en particulier de la capacité de TBK-1/IKK à déclencher une réponse antivirale, nous a amené à évaluer l'activité des ces kinases dans l'infection par le VHC. Nous avons montré que NS3/4A n'affecte pas directement la capacité intrinsèque de TBK1 ou de IKK à phosphoryler IRF3 ou à induire l' IFN mais agit en amont en interférant avec deux voies de signalisation (TRIF et RIG-I) qui conduisent à l'activation de ces kinases (Fig.5). Nous avons également montré que la surexpression de TBK1, et surtout celle de IKK, dans une lignée exprimant le réplicon du VHC est capable de restaurer l'expression des gènes induits par IRF3. Nous caractérisons actuellement le mécanisme d'action antivirale d'IKK. Sa surexpression pourrait renforcer la défense immune innée dans l'infection par le VHC, favoriser l'élimination du virus de l'organisme et empêcher l'établissement d'une infection chronique.

Breiman,A., Grandvaux,N., Lin,R., Ottone,C., Akira,S., Yoneyama, M., Fujita,.T., Hiscott, J.and Meurs,E.F Inhibition of RIG-I-dependent signaling to the interferon pathway during hepatitis C expression and restoration of signaling by IKK. Journal of Virology ( in press)

Légendes des photos :

Figure 1

A : Représentation schématique d'un réplicon complet du VHC

Le plasmide pFK-I398/neo/Core-3' contenant le génome complet d'un VHC de génotype 1b a été obtenu du groupe du Dr Bartenschlager (Pietschmann, T. et al, 2002. J Virol 76:4008-4021). Le gène de résistance à la Néomycine sous contrôle de l'IRES du VHC (en 5') est suivi du génome complet du VHC sous contrôle de l'IRES du virus EMCV. Ce génome code pour les protéines structurales (Capside (C), Enveloppes ( E1 et E2), viroporine (p7) et les protéines non structurales (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A et l'ARN polymérase ARN-dépendante NS5B).

B : Expression du réplicon du VHC

Détection par immunofluorescence de quelques-unes des protéines du réplicon complet du VHC s''exprimant dans une lignée Huh-7 sous pression de sélection avec 100 μ g/ml de Néomycine. La protéine d'enveloppe E2 et les protéines non structurales NS3, NS4B et NS5A sont révélées à l'aide d'anticorps, soit généreusement fournis par Jean Dubuisson; CNRS-UPR2511; Lille (anti-E2), Darius Moradpour (Université de Freiburg (anti-NS3), Haralabia Boleti ( Institut Pasteur Héllénique ; anti-NS4B), soit commerciaux (Biodesign ; anti-NS5A).

Figure 2 Analyse par microscopie électronique des nucléocapsides du VHC isolées à partir de sérum de patient par microscopie électronique. Les particules virales ont été adsorbées sur la grille de microscope par les anticorps anti-capside. Les nucléocapsides ont majoritairement 38-43nm de diamètre. Coloration directe avec 1% d'acétate d‘ uranyle.

Figure 3. Localisation de la protéine de la capside du VHC dans le foie de chimpanzé au cours de l'infection expérimentale par le VHC. Immunofluorescence indirecte en utilisant un anticorps monoclonal produit par immunisation avec les nucleocapsides non-enveloppées purifiées à partir d'un sérum de patient.

(a) Coloration indirecte avec le Mab anti-capside suivie de la révélation avec des anti-IgM de souris conjugués au FITC

(b) Analyse de tissu hépatique marqué avec le Mab anti-capside par microscopie confocale

Figure 4.

Représentation schématique de l'attachement d'un anticorps anti-capside sur la protéine de la capside du VHC par " bipolar bridging " (pontage bipolaire)

Attachement des IgG " non-immunes " sur le site " Fcγ R-like "  via le domaine Fcγ

Attachement des anticorps anti-capside sur la protéine de la capside par les domaines Fab et Fcγ en même temps par " bipolar brigding " 

Figure 5

Voies d'induction de l'IFN. L'interaction et/ou l'entrée d'un virus avec une cellule peut entrainer l'induction de l'IFN par au moins deux voies de signalisation: la voie TRIF et la voie RIG-I. TRIF (TIR-domain-containing adapter-inducing IFN) est une protéine adaptatrice qui s'associe à la partie intracytoplasmique de TLR3, un membre de la famille des récepteurs Toll-like, lorsque ce recepteur reconnaît dans le milieu extracellulaire la présence d'ARN bicaténaire (dsRNA), ce dernier ayant pu provenir de cellules infectées. RIG-I est une autre protéine adaptatrice qui s'associerait via son domaine ARN hélicase avec de l'ARN bicaténaire intracytoplasmique, par exemple de l'ARN viral. Cette association provoquerait un changement de la conformation de RIG-I et entrainerait son interaction avec d'autres protéines via son domaine N-terminal CARD (CAspase Recruitment Domain). Les voies TRIF et RIG-I conduisent via des intermédiaires encore mal connus à l'activation des deux protéines kinases TBK1 (TANK-binding kinase1) et IKK. Celles-ci sont responsables de la phosphorylation du facteur de transcription IRF-3 pour la phase précoce d'induction de l'IFN puis celle du facteur de transcription IRF-7 (non montré) pour la phase tardive. IRF3 migre dans le noyau et active le promoteur de l'IFNα ainsi que les promoteurs de quelques autres gènes ( par exemple : ISG56, ISG15, RANTES, IP-10) qui peuvent aussi jouer un rôle dans la réponse immune innée.

Mots-clés: VHC, Interferon, NS3/4A, nucléocapside virale, récepteurs cellulaires, SR-BI/Cla1, récepteur Fc_