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     Génétique Moléculaire - CNRS URA 2172


  Responsable : Pugsley, Anthony P (max@pasteur.fr)


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Les activités de notre unité sont focalisées sur la quête d'une meilleure connaissance de deux aspects fondamentaux de la vie cellulaire : la réponse aux stimuli spécifiques par un changement au niveau de la transcription de certains gènes et l'étude de complexes macromoléculaires de l'enveloppe impliqués dans les échanges entre la cellule et le milieu extérieur. La plupart de nos études sont menées chez la bactérie Escherichia coli, mais elles se situent très clairement dans les disciplines de la biologie moléculaire, cellulaire et structurale plutôt que celle de la microbiologie.



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Dans une période où de plus en plus d'études sont consacrées à la biologie intégrative, il est essentiel de renforcer l'investigation moléculaire de mécanismes fondamentaux qui constituent les véritables bases de la vie. Ainsi, nous sommes motivés à poursuivre en profondeur nos études de deux processus universels, la perception de signaux et leur transduction aux circuits de régulation génétique, et l'étude de l'adressage et l'assemblage de protéines intra- et extracellulaires. Nous avons choisi d'étudier ces processus chez les bactéries, qui offrent des avantages considérables sur des systèmes expérimentaux plus complexes. Cependant, nos études ont un impact qui dépasse très largement les frontières de la microbiologie classique.

Nos études sur la perception et la transduction de signaux ont pour origine nos anciennes analyses du métabolisme des maltodextrines chez E. coli. L'élément central du contrôle génétique de ce système est la protéine MalT, l'activateur transcriptionnel qui régule les promoteurs de tous les opérons de gènes nécessaires au transport et au métabolisme du maltose et des maltodextrines. La transition de MalT vers sa forme active dépend de la fixation d'une petite maltodextrine, le maltotriose, qui induit la multimérisation de l'activateur. L'activation et la multimérisation de MalT sont spécifiquement inhibées par trois protéines, dont MalK, l'ATPase de la perméase des maltodextrines située dans la membrane interne. MalK et le maltotriose sont en compétition pour la fixation à MalT. Nos études actuelles sont destinées à mieux définir au niveau de MalT les sites sur lesquels se fixent MalK et le maltotriose et les transitions structurales qui en résultent. Nous avons également commencé à étudier le rôle de l'activité ATPase de MalT dans le processus d'intégration de signaux régulateurs. Nos études de la protéine MalT devraient contribuer de manière significative à la compréhension des mécanismes par lesquels les ATPase de la famille STAND, dont MalT est le prototype, répondent à de multiples signaux régulateurs.

Nos récentes études du trafic protéique découlent de notre ancienne observation que la production et la sécrétion d'une enzyme amylolytique chez la bactérie Klebsiella oxytoca, une " cousine " d'E. coli, dépendent de la protéine MalT. La sécrétion en deux étapes de la pullulanase requiert le système universel Sec pour son transport à travers la membrane interne et un système dédié, le sécréton, dont l'expression est contrôlée par MalT, pour son transfert à travers la membrane externe. Le sécréton est une machinerie complexe composée de 13 protéines que nous étudions afin de comprendre comment la pullulanase est propulsée à travers la membrane externe. Deux des composants du sécréton ont retenu notre attention pour une étude structurale. L'examen par cryomicroscopie électronique de la protéine D, la sécrétine, indique une structure dodécamérique sous forme d'un tonneau avec un bouchon au centre. Il est probable que la pullulanase franchit la membrane par l'intérieur de ce tonneau après déplacement de son bouchon. Nous avons également proposé que ce mouvement résulte de cycles d'assemblage et de désassemblage d'un pilus périplasmique composé de la protéine G, la pseudopiline, que nous avons étudié par cristallographie aux rayons X et par microscopie électronique. Enfin, nous avons identifié plusieurs régions de la pullulanase qui semblent essentielles à sa sécrétion. L'analyse de la structure de la pullulanase aux rayons X, qui est en cours, nous indiquera la position exacte de ces régions et nous permettra d'identifier les acides aminés impliqués dans les interactions avec les différents composants du sécréton. Les modèles structuraux et conceptuels basés sur les résultats de ces études sont en cours de validation par des approches génétiques, biochimiques et structurales.

Nous nous intéressons également à l'assemblage du sécréton et, en particulier, à son site d'assemblage dans l'enveloppe bactérienne. Des résultats récents obtenus avec des chimères composées de protéines fluorescentes rouges ou vertes fusionnées à un composant du sécréton indiquent que les chimères sont actives et semblent s'assembler au niveau de sites discrets dans l'enveloppe. Ces résultats nous mèneraient vers une étude des interactions moléculaires entre les différents composants du sécréton, son dynamisme et, par la suite, vers des aspects plus généraux de l'organisation cellulaire.

Un autre aspect de notre travail concerne les systèmes de sécrétion peu caractérisés. Les bactéries à Gram-négatif possèdent plusieurs systèmes, dont le sécréton, pour permettre à des protéines extracellulaires de franchir la membrane externe, mais qu'en est-il pour les bactéries à Gram-positif de la famille Corynebactérineae, qui possèdent également une membrane externe ? Nous avons choisi d'étudier une protéine de Corynebacterium glutamicum qui forme une tunique à la surface de la bactérie. Comment cette protéine traverse t-elle la membrane externe ? Deux mutations engendrées par l'insertion d'un transposon semblent affecter ce processus. Leur caractérisation va certainement nous mettre sur la piste d'un nouveau système de sécrétion que nous étudierons par la suite par des approches biochimiques et structurales.

Notre unité s'est intéressée depuis longtemps aux lipoprotéines, une classe particulière de protéines exportées qui possèdent, à leur N-terminus, une cystéine triacylée qui les ancrent dans la membrane. Nos récentes études des mécanismes par lesquels les lipoprotéines sont localisées dans l'enveloppe nous ont amenés à analyser les enzymes responsables de leur acylation et leur maturation protéolytique. En particulier, nous avons démontré que l'enzyme responsable de l'addition du troisième acide gras, la lipoprotéine N-acyltransférase, est essentielle chez E. coli. En son absence, les lipoprotéines de la membrane externe ne sont pas correctement acheminées. La cartographie de l'enzyme, une protéine intégrale de la membrane interne, indique la présence du site catalytique dans une grande boucle périplasmique de l'enzyme. Nous souhaitons élargir nos études à d'autres bactéries, identifier les acides aminés impliqués dans la catalyse et mieux comprendre la relation structure-fonction de l'enzyme d'E. coli.

Photo :

Structure de la protéine PulG, composant du sécréton de K. oxytoca et du pilus qu'elle forme

Mots-clés: Transduction du signal, activation de transcription, sécrétion, lipoprotéines



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Lavenir, Armelle, (alavenir@pasteur.fr) Bayan, Nicolas, Université de Paris XI, (Maître de Conférences, nbayan@pasteur.fr)

Danot, Olivier, Institut Pasteur, (Chargé de Recherche, olivdano@pasteur.fr)

Francetic, Olivera, Institut Pasteur, (Chargé de Recherche, ofrancet@pasteur.fr)

Richet, Evelyne, CNRS, (DRII, erichet@pasteur.fr)

Buddelmeijer, Nienke, Postdoc

Joly, Nicolas, Thésard

Lewenza, Shawn, Postdoc

Marquenet, Emélie, Thésard

Niellez Sandy, Master II

Porcelli, Ida, Postdoc

Robichon, Carine, Thésard

Selle Olivier, Master II

Vignon, Guillaume, Thésard

Guilvout, Ingrid, (Ingénieur, ingvout@pasteur.fr)

Nadeau, Nathalie, (Technicienne, nnadeau@pasteur.fr)

Reyngoud, Maria, (Agent de laboratoire)

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