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     Génétique et Epigénétique de la Drosophile


  Responsable : Christophe Antoniewski (antoniew@pasteur.fr)


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Notre groupe s'intéresse aux mécanismes de contrôle transcriptionnel et post-transcriptionnel au cours du développement des métazoaires. Notre modèle expérimental, la drosophile, nous permet d'aborder ces problématiques en combinant des approches génétiques et moléculaires. Deux projets de recherche sont poursuivis. (i) L'étude de la fonction de l'histone-acétyltransférase (HAT) dGcn5 et de son rôle dans le contrôle génétique et épigénétique du développement. (ii) l'analyse des mécanismes de répression post-transcriptionnelle par les ARN double-brin inhibiteurs (RNAi) et les micro-RNA.



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1. L'histone-acétyltransférase dGcn5

Dimitri Szymczak, Clément Carré

L'acétylation des histones par les histone-acétyltransférase induit une modulation de la structure chromatinienne et de la transcription des gènes.

Comment les HAT – et le code épigénétique de modification des histones qu'elles génèrent – contribuent-elles à la régulation des programmes génétiques ?

L'étude de la protéine dGcn5 chez la drosophile devrait contribuer à établir un tableau intégré du rôle d'une HAT dans la régulation des programmes génétiques, au cours du développement d'un organisme complexe.

Cette année, nous avons achevé l'isolement et la caractérisation de plusieurs mutations du gène Gcn5 induites au cours d'une mutagenèse par exposition à l'éthyle-méthyle-sulfonate. L'analyse des phénotypes des mutants nuls Gcn5 indique que la protéine Gcn5 n'est pas requise pour le développement larvaire. En revanche ces mutants se révèlent incapables d'effectuer leur métamorphose, qui permet de passer de l'état larvaire à l'état d'insecte adulte. Des mutations hypomorphes de Gcn5 permettent la survie de quelques adultes. Ceux-ci présentent cependant de graves défauts de morphogenèse des appendices (pattes, ailes, etc…). Ces résultats, associés à la mise en évidence, par coimmunoprécipitation, d'une interaction entre Gcn5 et la protéine Ecdysone Receptor, indiquent que Gcn5 remplit un rôle critique de coactivateur des programmes génétiques spécifiques induits au cours de la métamorphose par le pic d'hormone stéroïde ecdysone. En utilisant des outils d'inactivation génétique par interférence par l'ARN, Nous avons également effectué plusieurs observations montrant que Gcn5 participe, dès la fin de l'embryogenèse, à la régulation du cycle cellulaire des cellules imaginales des larves de drosophiles, à partir desquelles se développent les structures adultes.

Nous avons analysé par des méthodes d'immunomarquage, les effets de la perte de fonction de Gcn5 sur l'acétylation des chromosomes, au niveau des glandes salivaires larvaires, ou dans les disques imaginaux. Nous avons constaté (Fig. 1) une perte complète d'acétylation des résidus K9 et K14 des histones H3 dans les mutants nuls Gcn5. En revanche, l'acétylation des résidus K8 et K16 des histones H4 n'est pas affecté. Nous montrons ainsi que Gcn5 est l'HAT majeure des résidus H3-K9 et K14 chez la drosophile.

Figure 1

Nous avons établi une collection de lignées transgéniques exprimant la protéine Gcn5 sauvage ou mutée dans ses différents domaines remarquables (site catalytique HAT, bromodomaine, domaine d'interaction avec les récepteurs nucléaires, domaine d'interaction avec les protéines Ada). Nous avons analysé (i) la capacité de ces différents variants à sauver la létalité des mutants Gcn5 ainsi que leur capacité de cibler la chromatine et d'en acétyler les histones. Nos résultats indiquent que le domaine catalytique HAT ainsi que les domaines d'interaction avec les récepteurs nucléaires et les protéines Ada sont strictement requis pour la pleine fonction de Gcn5. Cependant, les variants Gcn5 dépourvus du domaine d'interaction avec les récepteurs nucléaires ou les protéines ada se localisent et acétylent normalement les chromosomes polytènes des glandes salivaires. De façon surprenante, la protéine variante Gcn5 dépourvue de son bromodomaine se révèlent parfaitement fonctionnelle et capable de sauver complêtement les mutants Gcn5.

2. Analyse des mécanismes d'interférence génétique par l'ARN double-brin et les micro-ARNs.

Hélène Thomassin, Delphine Fagegaltier et Bassam Berry.

L'introduction d'ARN double-brin dans la cellule provoque la dégradation de l'ARN messager de séquence correspondante. Ce processus d'interférence par ARN (RNAi) est à la base de systèmes de régulation endogènes. Chez les plantes, il sert de mécanisme de défense contre les virus lors d'une infection. Un nombre croissant de données indiquent par ailleurs que l'expression d'ARN double brin correspondant aux séquences centromériques des chromosomes est responsable de leur hétérochromatinisation. Enfin, des mécanismes apparentés au RNAi se révèlent impliqués dans des phénomènes de co-suppression génique, de répression de l'activité d'éléments transposables et d'empreintes chromosomiques parentales.

Les micro-RNA sont de petits ARN en " épingle à cheveux " partiellement double-brin, codés par le génome. Il en est maintenant décrit plus d'une centaine, chez la drosophile comme chez les vertébrés. Leur maturation met en jeu des voies métaboliques communes avec celles de l'interférence par ARN. Cependant, au lieu de provoquer la dégradation de leurs ARNm cibles, les micro-RNA agissent en inhibant leur traduction. Il est récemment apparu que les micro-RNA sont impliqués dans des cascades de régulation génétiques contrôlant le développement, la prolifération cellulaire ou l'apoptose.

Figure 2

Nous avons abordé l'interférence par l'ARN chez la drosophile comme une méthode permettant de contrôler l'inactivation d'un gène dans un animal transgénique (Fig. 2). Le système développé à montré tout son intérêt dans la mesure où il permet de contrôler la dégradation d'un ARNm cible dans un tissus particulier ou à un stade donné du développement (Fig. 3). Nous souhaitons maintenant étudier la contribution des ARN double-brin aux mécanismes de régulations génétiques endogènes mis en œuvre par le génome. Pour cela, nous suivons deux lignes directrices.

Une première ligne consiste à analyser le rôle des micro-RNA dans le contrôle du développement de la drosophile.

En collaboration avec Pasteur-Génopole® , nous sommes en train de construire et de tester des puces à oligonucléotides permettant d'analyser globalement le niveau d'expression de tous les micro-RNA codés par le génome. Nous analysons par ailleurs l'effet sur le développement de plusieurs inhibiteurs protéiques des micro-RNA, dérivés de différents virus de plantes et d'insectes. Enfin, nous surexprimons dans des cellules en culture ou des animaux transgéniques des micro-ARN de séquence naturelle ou reprogrammée.

Une deuxième ligne consiste à tester, à l'aide des outils transgéniques que nous avons élaborés, si le ciblage d'ARN double-brin au niveau de séquences régulatrices non codantes peut induire une inactivation transcriptionnelle (Transcriptional Gene Silencing, TGS) et/ou une hétérochromatinisation des séquences ciblées.

Légendes des photos :

Figure 1.

A gauche. Etalement de chromosomes polytènes provenant de glandes salivaires de larves sauvages ou de larves mutantes Gcn5 (comme indiqué). Un marquage à l'aide d'un anticorps spécifique (rouge) révèle que l'acétylation du résidu K14 de l'histone H3 est complètement abolie dans le mutant Gcn5.

A droite. Un système transgénique permet de déclencher spécifiquement l'inactivation de Gcn5 par ARN interférence dans le compartiment postérieur de ce disque imaginal d'aile (partie droite). Un marquage avec le même anticorps spécifique révèle la disparition de l'acétylation du résidu H3-K14 dans ce compartiment.

Figure 2

A gauche. Système transgénique pour cibler l'interférence par l'ARN chez la drosophile.

Une lignée exprimant le facteur GAL4 sous le contrôle d'une promoteur spécifique est croisée avec une lignée transgénique pour une séquence en répétition inverse sous le contrôle de sites de régulation UAS, cibles de GAL4.

A droite. Contrôle tissulaire de l'inactivation du gène Gcn5 par RNAi.

L'expression d'un transgène induisant un RNAi contre Gcn5 est visualisée grâce à la coexpression du marqueur fluorescent GFP (en vert), au niveau du territoire présomptif distal d'un disque imaginal de patte (en haut) ou de part et d'autre de la frontière dorso-ventrale dans un disque imaginal d'aile (en bas). L'expression de la protéine Gcn5, révélée par un anticorps spécifique (en rouge), est spécifiquement abolie au niveau de ces territoires.

Mots-clés: Drosophile, Génétique, Epigénétique, Histone acetyltransférase, interférence par l’ARN, micro-RNA



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  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Dulieu Isabelle p8986 email : idulieu@pasteur.fr Hélène Thomassin – CR CNRS – hthomass@pasteur.fr

Delphine Fagegaltier – Chercheuse Contractuelle IP – delphine@pasteur.fr

Bassam Berry – Etudiant en Thèse – bassam@pasteur.fr

Clément Carré – Etudiant en Thèse – carre@pasteur.fr

Caroline Jacquier – Stagiaire M2 – caroline@pasteur.fr Josette Pidoux – Technicienne Supérieure IP – jpidoux@pasteur.fr

Harry Dualot – Personnel de Laverie


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