Le répertoire comportemental de l'animal nécessite l'établissement de connexions neuronales spécifiques au cours de l'embryogenèse. L'analyse de la spécification génétique et du fonctionnement des circuits neuronaux pendant l'embryogenèse est au centre de nos activités de recherche. Des outils génétiques sont développés pour une imagerie moléculaire qui permette de visualiser l'organisation synaptique fonctionnelle des circuits neuronaux pendant leur mise en place et leur maturation dans des animaux transgéniques.

I - Analyse génétique de l'organisation synaptique fonctionnelle au cours du développement du cerveau murin

Nous avons construit des protéines hybrides entre un fragment non toxique de la toxine tétanique (TTC) et un gène rapporteur, LacZ ou GFP. Les molécules hybrides conservent les propriétés de transport rétrograde et trans-synaptique de la toxine et renseignent sur la signalisation rétrograde dans des circuits neuronaux. Les voies de signalisation antérograde et rétrograde sont essentielles à la maturation et au fonctionnement de la synapse, pendant le développement et la vie adulte. Nous cherchons à caractériser le transport rétrograde et trans-synaptique détecté par nos sondes GFP-TTC à la jonction neuromusculaire et à la synapse centrale, mais aussi dans des situations physiologiques du système nerveux en développement. Des informations sur les voies d'endocytose et de propagation des toxines dans le SNC seront aussi obtenues. En parallèle, une approche d'imagerie calcique de l'activité dans des ensembles neuronaux est poursuivie avec le gène bioluminescent sensible au calcium GFP-aequorine.

a) La jonction neuromusculaire (Cécile Saint Cloment, collaboration UPR9040 du CNRS Sylvie Roux et Jordi Molgo)

La neurotoxine tétanique au cours de l'évolution a parasité des voies cellulaires constitutives pour son internalisation et son transport. L'utilisation de protéines hybrides, contenant le fragment C-terminal atoxique de la neurotoxine tétanique, permet l'analyse in vivo de ces voies d'endocytose impliquées dans le transport intra- et intercellulaire. Par injection intramusculaire, on observe une concentration très rapide des protéines de fusion correspondantes à la jonction neuromusculaire.

Ces protéines, après internalisation neuronale, sont transportées de façon rétrograde jusqu'aux dendrites du motoneurone puis dans les cellules interconnectées. La dynamique de cette concentration et de cette internalisation dépend de l'activité nerveuse pré-synaptique et fait intervenir en partie des microdomaines lipidiques. D'autre part, ce transport in vivo, est fortement influencé par différents facteurs neurotrophiques. On visualiserait donc ainsi une connexion entre l'activité nerveuse via la signalisation rétrograde et le trafic membranaire de ces radeaux lipidiques. Un tel trafic représenterait un mécanisme d'intégration et de transmission de l'information au sein du réseau neuronal actif. La caractérisation des mécanismes, des structures cellulaires ainsi que des facteurs cellulaires et moléculaires impliqués dans l'endocytose de ces marqueurs cellulaires nécessite des observations par microscopie optique mais également électronique ainsi que différentes études biochimiques et électrophysiologiques.

b) Caractérisation du trafic vésiculaire dans des réseaux neuronaux simples (Rafael Vazquez-Martinez)

Le but principal du projet est d'élucider les divers aspects cellulaires de la signalisation rétrograde détectée avec TTC dans le système nerveux central. Nous utilisons donc les caractéristiques du fragment c terminal de la toxine tétanique couplée à la GFP, à savoir son accrochage à la membrane des neurones ainsi que son transport transneuronal. L'endocytose et la transcytose de TTC implique des mouvements de vésicules et de membranes qui sont régulés entre autres par un facteur neurotrophique abondant le BDNF. Nous postulons que ces trafics vésiculaires apportent et emportent aux synapses actives, aussi bien du côté pré-synaptique que du côté post-synaptique, divers composés nécessaires au bon fonctionnement de la synapse active. Expérimentalement, pour vérifier ces hypothèses, nous utilisons la microscopie confocale time-lapse sur des neurones pyramidaux dans des coupes organotypiques , soumises à diverses conditions électrophysiologiques et pharmacologiques. Nous cherchons à visualiser les fluctuations de la fluorescence intracellulaire associée à TTC et à la corréler à des remodelages de la morphologie des épines dendritiques. Nous pensons ainsi obtenir des renseignements importants sur les mécanismes cellulaires impliqués dans les trafics membranaires à la synapse active.

c) Analyse de l'organisation synaptique fonctionnelle chez l'embryon et l'animal transgénique (Sandrine Picaud, Thomas Curie, Pierre Godement)

Des animaux transgéniques ont été construits dans lesquels le gène rapporteur GFP-TTC est placé sous le contrôle de promoteurs spécifiques du système nerveux central. L'imagerie du réseau neuronal est obtenue par la détection de la protéine après son transport à travers des synapses actives au sein du réseau. L'expression de la protéine GFP-TTC est particulièrement étudiée dans la rétine et des expériences fonctionnelles sont en cours de réalisation pour étudier le transport de cette protéine dans le système visuel.

D'autres lignées de souris utilisant la mutagenèse dirigée et le déclenchement conditionnel pour l'expression du gène rapporteur sont en construction pour l'étude des mécanismes génétiques sous-jacents à la mise en place des réseaux au cours du développement. L'imagerie par microscopie confocale à multiphotons permet de suivre le transport intracellulaire et trans-synaptique de la protéine traceur. Cette approche d'imagerie moléculaire permettra de mieux comprendre la plasticité synaptique des réseaux neuronaux.

d) Visualisation de l'activité neuronale par imagerie bioluminescente (Kelly Rogers, Cendra Agulhon,Jacques Stinnakre, Sandrine Picaud)

Nous avons développé une approche expérimentale pour visualiser en temps-réel l'activité d'un réseau neuronal dans un tissu nerveux ou dans l'animal entier en utilisant la protéine bioluminescente sensible au calcium GFP-aequorine (GA). La fluorescence de la GFP permet de visualiser le profil d'expression du gène rapporteur dans la cellule. De plus, lorsque le calcium s'accroche à l'aequorine, un transfert d'énergie chemiluminescence a lieu, appelé CRET. Il s'ensuit que la GFP émet une lumière bioluminescente verte bien plus intense que celle produite par l'aequorine seule. Cette luminescence, induite par le calcium, ne demande pas une stimulation par une radiation et son excellent signal au bruit lui permet d'être utilisée pour une imagerie de très longue durée sans effets nocifs sur les tissus. Nous avons montré que cette protéine pouvait être génétiquement ciblée à différents compartiments cellulaires et protéines, notamment dans les parties pré et post-synaptiques sans perte de fonction. Des animaux transgéniques ont été construits avec plusieurs sondes GA ciblées pour visualiser les activités de réseaux à différents stades de leur développement. Dans le premier animal transgénique, GA, ciblé à la mitochondrie, peut être exprimé dans n'importe quelle cellule embryonnaire ou adulte. L'unité de transcription est contrôlée par un système d'activation conditionnelle Cre/lox qui permet de cibler spécifiquement des sous populations de cellules nerveuses ou gliales. Les activités spontanées peuvent ainsi être suivies dans des types cellulaires définis du cerveau. Les activités rythmiques récurrentes dans le néocortex sont en cours d'étude et seront tout particulièrement analysées en relation à certaines périodes critiques du développement. Dans un second animal transgénique, la protéine hybride PSD-95-GA devrait être exprimée de façon conditionnelle dans les cellules pyramidales du néocortex et de l'hippocampe. Dans ce cas, la protéine sensible au calcium est localisée dans le voisinage du récepteur NMDA dans les compartiments post-synaptiques.

Les dynamiques calciques sont suivies " en temps réel " par l'imagerie en bioluminescence sur l'animal transgénique vivant et non anesthésié.

Ces études permettront de visualiser les changements dynamiques d'activité dans des circuits neuronaux actifs, avec une résolution temporelle inégalée dans des tissus normaux et pathologiques.

Nous avons construit un virus exprimant la sonde bioluminescente GFP-aequorine capable d'infecter spécifiquement les cellules gliales de la rétine, ce qui fait de ce virus un outil idéal pour mesurer les activités calciques dans ce type cellulaire. Par ailleurs la protéine GFP-aequorine cytoplasmique produite dans les cellules infectées de tranches organotypiques de rétine est fonctionnelle et stable. En effet, elle nous permet (1) de détecter des activités calciques déjà observées dans la littérature avec des colorants fluorescents et (2) de mesurer des réponses calciques après plusieurs stimulations par l'ATP du même échantillon. Enfin, l'imagerie bioluminescente nous a aussi permis de mesurer des activités calciques spontanées ce qui démontre que cette technique d'imagerie est très adaptée pour l'étude des activités calciques spontanées et évoquées dans des tranches de tissus nerveux.

II - Isolement de cellules souches à partir de cellules somatiques (H. Le Mouellic)

Au cours de ces dernières années, des animaux vivants ont été obtenus après transplantation de noyaux de cellules somatiques dans l'œuf. Cette technique a été couronnée de succès chez de nombreux mammifères. Par ailleurs, la fusion d'une cellule souche embryonnaire (ES) avec une cellule somatique produit un hybride cellulaire possédant des propriétés de pluripotence. Des facteurs encore non identifiés, mais localisés dans le cytoplasme de l'œuf ou exprimés dans les cellules ES, permettent de réinitialiser le programme génétique du développement et reprogramment les gènes de façon coordonnée. Ce phénomène intervient aussi naturellement, par exemple chez l'amphibien Urodèle lorsqu'une patte est sectionnée. Des cellules somatiques dédifférencient, prolifèrent et reforment de nouveaux tissus. Sachant que la reprogrammation génétique peut se faire, nous étudions la possibilité d'isoler directement des cellules souches à partir de cellules somatiques, par mutagenèse exhaustive.

Nous avons construit une lignée de souris transgéniques comprenant un marqueur génétique des cellules pluripotentes. Un promoteur minimal a été associé aux séquences activatrices qui sont responsables de l'expression de Oct-4 dans les cellules souches embryonnaires (ES). Le marqueur est une protéine de fusion qui expose la protéine fluorescente verte (GFP) sur la surface externe des cellules (photo). Le transgène est correctement exprimé dans les cellules ES, les embryons pré-implantatoires et la lignée germinale des animaux transgéniques. Une mutagénèse insertionnelle par vecteurs viraux pourrait être effectuée sur différentes populations cellulaires obtenues à partir de ces souris. La présence de plusieurs épitopes permet d'isoler les rares évènements positifs en utilisant la puissante technique du tri magnétique.

Légendes des photos :

photo 1 : Localisation du marqueur GFP-TTC à la jonction neuromusculaire. Après injection in vivo à proximité du muscle Levator auris longus, GFP-TTC (vert) est localisé très rapidement au niveau de la jonction neuromusculaire. Les axones moteurs associés sont visualisés à l'aide d'un anticorps antineurofilament 200(rouge).

photo 2 : Image par microscopie confocale multiphotonique d'un neurone pyramidal cortical dans une coupe organotypique de 400 μ m, exprimant GFP-TTC (Echelle : 15μ m)

photo 3 A) Bioluminescence induite par du calcium dans des neurones corticaux exprimant la GFP-aequorine, B) fluorescence de la GFP, C) image par transmission. Pseudo-couleurs correspondant á 1 - 9 photons/pixel

photo 4 : Propagation de vagues calciques dans les cellules de Müller de rétine de souris adulte après des stimulations par application d'ATP.

Après infection avec un adénovirus, la protéine GFP-aequorine est spécifiquement exprimée dans les cellules de Müller comme le montre la colocalisation avec le marqueur S-100 β-subunit des cellules de Müller, et l'absence de colocalisation avec le marqueur protéine kinase C α des cellules bipolaires.
Schéma de la rétine montrant la localisation des différents types cellulaires et image correspondante d'une coupe de rétine adulte.
Propagation d'une vague calcique dans les cellules de Müller après stimulation ATP.
réponses calciques (photons/s) de six régions d'intérêt différentes (20 µm de diamètre). Abréviations, GCL, couche des cellules ganglionnaires ; INL, couche nucléaire interne ; ONL, couche nucléaire externe; RPE, épithélium pigmentaire.

photo 5 : GFP ciblée à la surface de cellules HEK 293

Mots-clés: Neurobiologie du développement, dé-différenciation, organisation synaptique, imagerie calcique, transgenèse, cellule-souche