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     Choléra et des Vibrions


  Responsable : FOURNIER Jean-Michel (fournier@pasteur.fr)


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Le choléra représente encore aujourd'hui un problème majeur de santé publique à l'échelle mondiale. Notre Unité de recherche poursuit la lutte contre ce fléau selon plusieurs approches : (1) la surveillance et l'épidémiologie moléculaire du choléra; (2) le développement d'un test de diagnostic rapide du choléra ; (3) la mise au point d'un nouveau vaccin conjugué chimiquement défini. Nous nous intéressons aussi aux infections humaines à vibrions non cholériques et à la caractérisation moléculaire des souches qui en sont responsables. Notre laboratoire est désigné par le Ministère de la Santé "Centre National de Référence des Vibrions et du Choléra" en raison de son expertise dans le domaine des vibrions cholériques et non cholériques.



  rapport

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1. Surveillance et épidémiologie moléculaire du choléra (Marie-Laure QUILICI)

Le choléra reste aujourd'hui une maladie grave, autant pour les individus que pour les collectivités. Selon l'OMS, à la suite de la dégradation des conditions socio-économiques survenue ces dernières années dans de nombreuses régions du monde, le nombre de personnes exposées à cette maladie a augmenté de façon spectaculaire, créant les conditions d'un problème majeur à l'échelle mondiale.

Les cas de choléra dus à Vibrio cholerae O1 ou à V. cholerae O139 sont signalés dans tous les continents. Comme la plupart des pays développés, la France n'est pas directement concernée par des épidémies de choléra. Cependant des cas de choléra importés sont régulièrement diagnostiqués chez des voyageurs. C'est pourquoi nous collaborons avec des biologistes de pays atteints par ces épidémies, avec les instituts du Réseau International des Instituts Pasteur et Instituts Associés, ainsi qu'avec des organisations humanitaires.

L'analyse, par des méthodes de typage moléculaire, de plus de 350 souches isolées sur une période de 30 années depuis l'arrivée du choléra en Afrique en 1970, a révélé un degré important d'homologie entre les souches de V. cholerae d'origine géographique différente et isolées à plusieurs dizaines d'années d'intervalle. Ce résultat est en faveur du caractère clonal des souches responsables de la 7ème pandémie cholérique. La base de données qui a pu être établie suite à ce travail représente un outil très utile, d'une part pour étudier de nouvelles souches de V. cholerae qui pourraient être importées en France et, d'autre part, pour suivre l'évolution des souches isolées actuellement en Afrique. Dans ce contexte, nous avons étudié cette année 114 souches de V. cholerae O1 provenant de 8 pays d'Afrique, plus particulièrement du Cameroun et du Sénégal, atteints par d'importantes épidémies de choléra en 2004. Nous avons aussi étudié plus de 150 souches de V. cholerae O1 isolées au Mexique entre 1991 et 2000.

2. Test de diagnostic rapide du choléra (Alain BOUTONNIER, Jean-Michel FOURNIER)

Dans le cadre de notre programme de recherche sur la vaccination contre le choléra, nous avions préparé des anticorps monoclonaux spécifiques des lipopolysaccharides de V. cholerae O1 et O139. Nous avons utilisé ces anticorps pour développer, en collaboration avec le Laboratoire d'Ingénierie des Anticorps de l'Institut Pasteur à Paris et avec l'Institut Pasteur de Madagascar, un test de diagnostic rapide du choléra. Ce test, fondé sur le principe de l'immunochromatographie, avait donné de très bons résultats lors d'évaluations menées au Bangladesh et à Madagascar. Cette année, la sensibilité et la spécificité de ce test ont été évaluées dans un centre de traitement des maladies diarrhéiques au Bangladesh, en comparaison avec deux autres tests commercialisés. Notre test est le plus spécifique et le plus sensible, quel que soit le degré de technicité des personnes qui l'ont utilisé. Cependant, comme ces évaluations ont été réalisées dans des sites bénéficiant d'une bonne infrastructure, il était intéressant d'effectuer une évaluation dans des conditions plus rustiques, dans lesquelles ce test de diagnostic rapide serait particulièrement utile. Dans ce but, une évaluation a été conduite à Beira (Mozambique), pendant une épidémie de choléra en 2004, par l'Institut International des Vaccins (Séoul, Corée), l'OMS et des organisations de santé publique. Notre test s'est révélé très efficace, dans des conditions identiques à celles que l'on trouve dans les zones urbaines des pays en développement, dans lesquelles le choléra est endémique.

3. Programme de recherche sur un nouveau vaccin conjugué chimiquement défini (Alain BOUTONNIER, Cyrille GRANDJEAN, Bruno DASSY, Jean-Michel FOURNIER)

Le choléra est une maladie diarrhéique épidémique provoquée par des bactéries appartenant à 2 sérogroupes de l'espèce Vibrio cholerae. Nous sommes actuellement dans la 7ème pandémie qui a débuté en Inde en 1961, envahi l'Afrique en 1970 et atteint l'Amérique Latine en 1991. Cette 7ème pandémie est due à V. cholerae sérogroupe O1, biotype El Tor, sérotypes Ogawa ou Inaba. Un nouveau sérogroupe de V. cholerae, O139, apparu en Inde en 1992, est actuellement en expansion en Inde et au Bangladesh et représente une menace mondiale, dans la mesure où il n'existe pas de protection croisée entre les deux sérogroupes. C'est pourquoi il est urgent de pouvoir disposer d'un vaccin anticholérique protégeant aussi bien contre V. cholerae O1 que contre V. cholerae O139, efficace à long terme chez tous les groupes d'âge, en particulier chez les enfants de moins de 5 ans.

Le point de départ de notre recherche a été de déterminer quels anticorps protègent l'homme contre le choléra. Nous avons démontré que des immunoglobulines G (IgG) monoclonales, dirigées contre la partie polysaccharidique du lipopolysaccharide de V. cholerae O1, porteuse de la spécificité des sérogroupes et sérotypes, sont protectrices dans un modèle d'infection expérimentale du souriceau nouveau-né. Nous avons alors commencé la préparation de vaccins anticholériques conjugués, constitués de polysaccharides de V. cholerae O1 ou de V. cholerae O139 couplés par une liaison covalente à une protéine porteuse de façon à induire une réponse thymodépendante de longue durée. Nous avons obtenu un vaccin, constitué de la partie polysaccharidique du lipopolysaccharide de V. cholerae O139 conjugué à l'anatoxine tétanique, qui induit chez la souris une réponse protectrice thymodépendante.

Cette année, dans le cadre de la préparation de l'évaluation clinique de ce vaccin conjugué dirigé contre V. cholerae O139, nous avons assisté sur le plan technique une société pharmaceutique produisant un lot " clinique " de vaccin. Nous avons aussi préparé de nouveaux conjugués constitués du polysaccharide de V. cholerae O1 avec, comme objectif, l'induction de l'immunogénicité d'un déterminant antigénique commun aux sérotypes Ogawa et Inaba. Nous avons plus particulièrement exploité la présence, sur ce polysaccharide, d'un groupe amine porté par la D-glucosamine du core. Plusieurs conjugués ont été préparés, en faisant varier le type de liaison entre le polysaccharide et la protéine porteuse, le rapport sucre/protéine, ainsi que la longueur du lien. Bien qu'ils soient antigéniques, aucun des conjugués n'a cependant induit une réponse thymodépendante chez la souris. Nous avons aussi poursuivi, par des méthodes immunochimiques et physicochimiques, l'étude de la structure du déterminant antigénique commun aux sérotypes Ogawa et Inaba de V. cholerae O1. La connaissance de cette structure pourrait avoir un impact important pour une approche rationnelle de la conception d'un conjugué.

4. Études moléculaires des vibrions non cholériques (Annick ROBERT-PILLOT, Marie-Laure QUILICI)

Les vibrions sont des bactéries à Gram négatif qui colonisent l'environnement marin. On distingue les "vibrions cholériques", incluant les isolats appartenant aux sérogroupes O1 et O139 de l'espèce V. cholerae, et les "vibrions non cholériques", incluant les isolats de V. cholerae appartenant aux sérogroupes autres que O1 et O139 - appelés V. cholerae non-O1/non-O139 - et les isolats appartenant aux autres espèces du genre Vibrio. Deux espèces sont plus fréquemment isolées en pathologie humaine : V. parahaemolyticus et V. vulnificus, et quatre autres espèces sont plus rarement isolées : V. alginolyticus, V. fluvialis, V. hollisae et V. mimicus.

Les modifications écologiques de l'environnement marin fournissent aux vibrions des conditions idéales pour leur prolifération. Le développement du commerce international et de la consommation des produits de la mer à l'état cru, ainsi que l'accroissement du nombre de personnes immunodéprimées, font craindre une augmentation du nombre d'infections dues aux vibrions non cholériques dans les pays européens. Aussi, une surveillance microbiologique de ces germes devrait-elle contribuer à en limiter les risques pour la santé publique.

Les méthodes classiques d'identification bactérienne ne sont pas adaptées à l'étude de souches de vibrions isolées de l'environnement, et l'importance des vibrions en santé publique justifie le développement de méthodes moléculaires pour détecter, identifier et caractériser les facteurs de pathogénicité des souches humaines ou environnementales (eau de mer, produits de la mer). A ce titre, nous avons poursuivi notre programme de développement et d'utilisation de méthodes moléculaires pour l'étude de trois espèces de Vibrio d'intérêt médical : V. parahaemolyticus, V. cholerae et V. vulnificus.

Depuis 1996, l'incidence des infections à V. parahaemolyticus a considérablement augmenté en Asie du Sud-est, au Japon et en Amérique du Nord. Cette augmentation est due à l'émergence d'un nouveau clone pandémique de V. parahaemolyticus, appartenant au sérovar O3:K6.

L'analyse de souches de V. parahaemolyticus isolées chez l'homme en France de 1997 à 2004, par PCR et par typage moléculaire (ribotypie, électrophorèse en champ pulsé, et PCR arbitraire) a montré l'émergence, en 1997, de souches appartenant au sérovar O3:K6, indifférentiables, par les méthodes utilisées, du clone O3:K6 isolé au Bangladesh en 1996 et responsable de la plupart des flambées d'infections à V. parahaemolyticus dans le monde. Les informations épidémiologiques recueillies chez les patients ont montré que 3 d'entre eux avaient consommé des produits de la mer récoltés dans des zones non contrôlées, et dans la même zone à plusieurs années d'intervalle. Ces resultats montrent que des souches de V. parahaemolyticus appartenant au nouveau clone pandémique O3:K6 ont été introduites il y a plusieurs années et persistent actuellement dans l'environnement côtier français.

La détection de ce nouveau pathogène en France, et les résultats obtenus les années précédentes, montrant que des souches pathogènes de V. parahaemolyticus sont présentes sur les côtes françaises en proportion plus importantes que ce qui est habituellement rapporté dans la littérature, devraient conduire à la mise en place d'un programme de surveillance visant à rechercher les isolats pathogènes de V. parahaemolyticus dans les eaux côtières et dans les produits de la mer français.

5. Activités du Centre National de Référence des Vibrions et du Choléra (Marie-Laure QUILICI, Jean-Michel FOURNIER)

Le CNRVC est responsable de l'identification des souches de vibrions cholériques à l'origine de cas de choléra survenant en France, où, comme dans de nombreux pays, cette maladie est à déclaration obligatoire. Un faible nombre de cas de choléra (inférieur à 5) surviennent chaque année en France et sont, pour la plupart, importés. Aucun cas n'a été identifié en 2004. La collaboration avec des biologistes de pays concernés par des épidémies de choléra et avec des organisations non gouvernementales nous permet d'étudier de nouvelles souches de vibrions cholériques susceptibles d'être importées en France.

Le CNRVC est aussi responsable de l'identification de souches de vibrions non cholériques d'origine humaine. Ces vibrions non cholériques sont à l'origine de gastro-entérites, d'infections de la peau et des tissus mous, de septicémies, et de diverses infections extra-intestinales comme des otites. Les patients ayant une pathologie sous-jacente immunosuppressive sont exposés à une dissémination rapide de l'infection causée par ces germes. Dans la majorité des cas, ces infections sont associées à un contact direct avec l'eau de mer ou à la consommation de produits de la mer, et surviennent pendant les mois les plus chauds de l'année.

En 2004, 8 cas humains d'infections à vibrions non cholériques ont été identifiés par le CNRVC. Quatre cas de septicémies et/ou de gastro-entérites ont été causés par V. cholerae non-O1/non-O139, 3 cas de gastro-entérites et 1 cas de septicémie ont été dus à V. parahaemolyticus. Toutes les souches de V. parahaemolyticus possédaient au moins l'un des gènes des deux hémolysines associées à la pathogénicité, mais aucune de ces souches n'appartenait au nouveau clone pandémique O3 :K6. Aucune des souches de V. cholerae non-O1/non-O139 ne possédait les gènes de la toxine cholérique.

Le CNRVC identifie également des souches de vibrions non cholériques isolées de produits de la mer importés en France. En 2004, parmi 198 souches étudiées, les espèces V. cholerae, V. parahaemolyticus et V. alginolyticus ont été le plus souvent rencontrées. Tous les isolats de V. vulnificus d'origine alimentaire possédaient le gène hly, indiquant que toutes ces souches sont potentiellement pathogènes. En revanche, un très faible pourcentage (<1%) de souches de V. parahaemolyticus isolées de produits de la mer importés possédait un gène d'hémolysine. Aucune des souches de V. cholerae non-O1/non-O139 isolées de produits de la mer ne possédait les gènes de la toxine cholérique.

Le CNRVC a participé a des enseignements post-universitaires. Il a aussi été impliqué dans la formation de microbiologistes et de cliniciens. Des formations sur les méthodes classiques et moléculaires d'étude des vibrions cholériques et non cholériques ont été dispensées à des microbiologistes, techniciens et étudiants de plusieurs pays (France, Bangladesh, Cameroun, Madagascar, Maroc, Mexique). Le CNRVC a également participé a des comités d'experts nationaux et internationaux sur la vaccination contre le choléra et l'évaluation du risque des vibrions dans les produits de la mer.

Légendes de la photo :

Le nombre de personnes vulnérables exposées au choléra continue d'augmenter dans de nombreuses régions du monde où un assainissement satisfaisant n'est pas assuré pour tous.

Mots-clés: choléra, vibrions, vaccination, conjugué, diagnostic, épidémiologie moléculaire, produits de la mer, santé publique



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FOURNIER Jean-Michel, Chef de Laboratoire IP, fournier@pasteur.fr

QUILICI Marie-Laure, Chargée de Recherche IP, quilici@pasteur.fr

ROBERT-PILLOT Annick, Post-doctorant, arp@pasteur.fr

GRANDJEAN Cyrille, Post-doctorant, cgrandje@pasteur.fr

AHMED Firoz, Doctorant (Bangladesh), ahmedf@pasteur.fr

BOUTONNIER Alain, Ingénieur IP, abouto@pasteur.fr

GUENOLE, Alain,Technicien IP, aguenole@pasteur.fr

LEMEE Laure, Technicienne IP, llemee@pasteur.fr



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