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     Chimie Organique


  Responsable : Bost Pierre-Etienne (pebost@pasteur.fr)


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Les travaux de l'Unité de Chimie Organique concernent la synthèse et l'étude de molécules biologiquement actives. L'accès à des molécules originales, la caractérisation de leurs structures et l'étude de leurs interactions biologiques, en collaboration avec d'autres unités pasteuriennes, constituent des outils essentiels d'identification des mécanismes normaux ou pathologiques. Avec l'objectif de mettre en évidence de nouvelles approches thérapeutiques, les laboratoires de l'Unité synthétisent des vaccins, des inhibiteurs d'enzymes ou des produits actifs sur des cibles biologiques potentielles. Les études biochimiques des nucléoside monophosphate kinases et des phosphatases complètent ce dispositif. Par ailleurs, un groupe de l'Unité conduit un programme de sélections in vivo et in vitro d'évolution dirigée d'enzymes.



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1. Synthèse peptidique

Le groupe peptide s'est spécialisé dans la synthèse et la purification de longs peptides (50-70 AAs) et de peptides modifiés.

Chimiokines/HIV

(Françoise Baleux, Yves-Marie Coïc)

Les chimiokines SDF-1a et Mip1-β/RANTES inhibent l'entrée du virus HIV dans les cellules CD4+ via les co-récepteurs CXCR4 et CCR5. Ces mini-protéines de 70 acides aminés sont accessibles à la synthèse chimique. L'avantage de la synthèse est de permettre l'introduction d'acides aminés non naturels, l'incorporation sélective de marqueurs et des modifications de la liaison peptidique.

Pour augmenter la stabilité de SDF1α vis-à-vis de l'elastase, des analogues comportant une liaison réduite (CH2-NH), un β-acide aminé (CH2-CO) ou D-acide aminé ont été synthétisés sur la position leu5. Plus récemment nous avons démontré que des oligosaccharides de type héparine/ héparane sulfate protègent SDF1α de la protéolyse.

Peptides anti-inflammatoires issus de NEMO

(Françoise Baleux, Yves-Marie Coïc)

En réponses à des stimuli très divers tels que les cytokines (TNF-a, l'IL-1) ou les endotoxines (LPS), la cellule active une série de gènes impliqués dans les réponses inflammatoires et immunitaires, l'oncogénèse et l'apoptose, gènes sous le contrôle de la voie de signalisation NF-kB. La protéine NEMO (NF-kB essential Modulator) joue un rôle essentiel dans l'activation de kinases IKK impliquées dans cette voie de signalisation. En collaboration avec F. Agou et M. Véron (Unité de régulation enzymatique des activités cellulaires), nous avons montré que des peptides issus du domaine d'oligomérisation de NEMO étaient capables d'inhiber l'effet du LPS à des concentrations micromolaires, ces peptides étant dépourvu d'effet cytotoxique. Environ 30 peptides de taille variable (30 à 60 acides aminés) ont synthétisés. Ces peptides ouvrent la voie vers de nouveaux composés anti-inflammatoires ou anti-tumoraux.

Récemment un peptide de 84 acides aminés, totalement soluble dans l'eau et recouvrant tout le domaine de CC2-LZ a été synthétisé pour des études RMN et cristallographiques.

2. De l'antigène saccharidique au vaccin antibactérien

Conjugués polysaccharide-protéine à potentiel vaccinal contre le choléra

(Laurence Mulard, Cyrille Grandjean)

En collaboration avec l'équipe de J-M. Fournier (Unité du Choléra et des Vibrions), nous avons pour objectif de développer un vaccin de type conjugué polysaccharide-protéine contre Vibrio cholerae sérogroupe O1, le principal responsable du choléra. Les données disponibles indiquent que la partie polysaccharidique du lipopolysaccharide (ppLPS) est la cible majeure de la protection. Cependant, sa toxicité chez l'homme interdit l'utilisation du LPS complet dans un vaccin. En conséquence, plusieurs conjugués de type néoglycoprotéine impliquant la ppLPS d'une souche de V. cholerae O1 sérotype Inaba ont été préparés. Tous sont antigéniques, mais le gain en immunogénicité observé jusqu'à présent est faible voir absent. L'étude est poursuivie en association avec une approche par analyse structurale.

Glycoconjugués chimiquement définis à potentiel vaccinal contre la dysenterie bacillaire

(Laurence Mulard, Catherine Guerreiro, Cyrille Grandjean)

Fondée sur la notion "d'épitope osidique protecteur", notre objectif principal est de développer des immunogènes chimiquement définis, exposant de manière multivalente une combinaison d'haptènes osidiques (épitopes B) et d'épitopes T appropriés indispensables à l'induction d'une mémoire.

Shigella flexneri, est le modèle utilisé pour démontrer le potentiel de l'approche glycoconjugués synthétiques et/ou semi-synthétiques dans le domaine des vaccins multivalents. En effet, la protection contre l'infection étant spécifique du sérotype infectieux, prévenir efficacement la forme sévère de dysenterie causée par S. flexneri requiert au minimum un vaccin trivalent.

Des haptènes osidiques synthétiques de différentes longueurs, représentatifs d'un épitope "protecteur" immunodominant porté par l'antigène O de S. flexneri sérotype 2a, ont été couplés selon une approche modulaire à un peptide T auxiliaire universel (glycoconjugués synthétiques, coll. F. Baleux) ou à une protéine porteuse compatible avec une utilisation chez l'homme (glycoconjugués semi-synthétiques). En collaboration avec A. Phalipon (Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire), nous avons montré que plusieurs des glycoconjugués semi-synthétiques évalués induisent chez la souris des taux en anticorps anti-oligosides et anti-LPS élevés. Nous avons également montré que les réponses en anticorps anti-LPS étaient, dans un modèle souris, protectrices contre l'infection par une souche homologue et fortement dépendante de la nature de l'oligoside. Nos données suggèrent en particulier qu'un pentadéca-oside synthétique parfaitement caractérisé mime efficacement l'antigène O naturel. Dans le but de confirmer cette hypothèse, l'analyse conformationnelle de l'antigène O de S. flexneri sérotype 2a et de divers fragments synthétiques de celui-ci est en cours (coll. M. Delepierre, Laboratoire de Résonance Magnétique Nucléaire des Biomolécules). Une étude clinique est envisagée.

Glycoconjugués porteurs de phosphorylcholine pour le développement de thérapies contre les infections respiratoires

(Sylvie Bay, Christelle Ganneau)

L'objectif est de développer une nouvelle approche thérapeutique, basée sur l'utilisation d'anticorps, pour combattre certaines infections bactériennes du tractus respiratoire (Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis). Dans ce but, nous avons synthétisé un mime d'un antigène naturel ubiquitaire exprimé à la surface des bactéries, la phosphorylcholine glycosylée, synthon à partir duquel nous avons préparé des conjugués protéiques ainsi qu'un dérivé biotinylé. Un haptène synthétique contenant GalNac-ChoP a été préparé. Le conjugué induit des anticorps spécifiques qui reconnaissent ChoP sur les deux bactéries phylogénétiquement éloignées que sont Streptococcus pneumoniae et Neisseria meningitidis (collaboration avec P. Lafaye, Unité de Génétique et Biochimie du Développement, et J-M. Alonso, Unité des Neisseria).

3. Glycopeptides synthétiques à potentiel vaccinal anti-tumoral

(Sylvie Bay, Teresa Freire, Christelle Ganneau)

En collaboration avec C. Leclerc et R. Lo-Man (Unité de Biologie des Régulations Immunitaires), notre programme de recherche vise à développer des vaccins synthétiques basés sur des marqueurs tumoraux saccharidiques. Nous avons ainsi mis au point un nouveau type d'immunogène : le MAG ou Multiple Antigenic Glycopeptide qui présente le marqueur tumoral de façon multivalente en association avec un épitope T CD4+ peptidique. Le caractère synthétique des MAG constitue un avantage de sécurité essentiel en vue de leur utilisation in vivo.

L'ensemble de nos résultats montre que le MAG est efficace pour générer des taux élevés d'anticorps spécifiques du marqueur saccharidique et pour prolonger la survie de souris porteuses de tumeur, après vaccination thérapeutique ou prophylactique.

Nous avons également préparé une nouvelle génération de composés potentiellement utilisables chez l'homme, en introduisant des épitopes T CD4+ "universels" au sein des structures. Ces composés sont très immunogènes chez des souris transgéniques pour les molécules HLA, ainsi que chez le singe. Les anticorps induits chez le primate peuvent entraîner une cytotoxicité anticorps-dépendante sur des lignées de tumeurs humaines.

Par ailleurs, dans la perspective d'une application clinique, nous développons de nouvelles méthodes de préparation enzymatique de glycoconjugués porteurs de marqueurs tumoraux, afin de diminuer les coûts de synthèse.

4 . Synthèse et propriétés de nucléosides non naturels

(Claudio Cadena, Laurence Dugué et Sylvie Pochet)

L' objectif est d'élargir la gamme des acides nucléiques qui peuvent être répliqués in vitro. Parmi les altérations structurales de l'ADN étudiées, nous avons exploité celle affectant la partie hétérocyclique du nucléoside. L'influence des modifications sur la reconnaissance de ces molécules par les enzymes de la biosynthèse des acides nucléiques est ensuite examinée in vitro. Plusieurs bases nucléiques découlant des bases puriques oxidées de l'ADN ont été synthétisées, ainsi que des oligonucléotides les contenant. De tels motifs sont intrinsèquement capables de former des liaisons hydrogène avec les bases canoniques, ainsi qu'avec eux-mêmes. L'étude de la reconnaissance de ces nucléosides par les enzymes de l'ADN et plus particulièrement les polymérases, est en cours.

5 . Nucléoside monophosphate kinases - synthèse d'inhibiteurs et activité antimycobactérienne d'analogues de nucléosides

(Hélène Munier-Lehmann, Edward Seclaman, Sylvie Pochet, Laurence Dugué, Cécile Gasse)

Les nucléoside monophosphate kinases (NMPKs) de M. tuberculosis, bactérie responsable de la tuberculose, constituent des cibles antimycobacteriennes potentielles. La structure tridimensionnelle de la TMPK ayant été résolue, différentes approches ont été retenues pour la recherche d'inhibiteurs : synthèse d'analogues du substrat naturel, criblage in silico de banques de molécules, conception de molécules non nucléosidiques. Les composés présentant des constantes d'inhibition de l'ordre du micromolaire sur la TMPK recombinante ont été testés sur des cultures de mycobactéries. Parmi des dérivés benzyl-substitués de la thymine synthétisés, deux d'entre eux ont montré une activité d'inhibition de croissance des souches BCG et H37Ra.

6. Protéine Phosphatases PP1/PP2A et apoptose : cibles thérapeutiques potentielles.

(Alphonse Garcia, Julien Guergnon, Véronique Hospital, Frédéric Dessauge,Victoria Dominguez, Anne Lambert, Anne Bristeau-Leprince)

In vivo les protéine phosphatases de type 1 (PP1) et 2A (PP2A) contrôlent 90% de la déphosphorylation des protéines sur les résidus ser/thr. PP1 et PP2A forment une famille de plusieurs holoenzymes d'expression ubiquiste qui sont produites par l'interaction spécifique entre des sous-unités (PP1c) ou des unités catalytiques AC (formés de l'association des isoformes de PP2Ac avec des isoformes des protéines structurales A/PR65) et une grande variété de sous-unités régulatrices qui sont impliquées dans le ciblage et/ou la régulation de l'activité enzymatique. Le groupe phosphatase étudie l'inhibition de processus pathologiques par transfert intracellulaire de peptides interférant avec les sites d'interaction des protéines de la famille PP1 et PP2A. Cette approche est fondée sur:

a- l'identification de biopeptides pénétrants dont les séquences présentent des sites d'interaction avec la phosphatase PP2A .

b- l'identification de deux motifs consensus [RK]-x-(0,1)-V-x-F et F-x-x-[RK]-x-[RK] impliqués dans l'interaction des protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2, avec la sous-unité catalytique de PP1.

PP2A est une cible anti-tumorale potentielle : l'interaction de la protéine adénovirale E4orf4 codée avec la sous-unité Ba de PP2A induit spécifiquement la mort des cellules tumorales via un mécanisme indépendant de la p53. L'identification et la caractérisation (comparaison cellules normales et cellules tumorales ex vivo, étude chez la souris) de peptides pénétrants mimant des sites d'interaction de diverses protéines avec la sous-unité Ba de PP2A permettrait de reproduire l'effet apoptotique induit par la protéine adénovirale. Dans le cadre du PTR-136 coordonné par Alphonse Garcia en collaboration avec les groupes de M-A Buendia, C.Rougeot et M.Huerre, nous rechercherons des peptides pénétrants capables de mimer in vitro le signal anti-tumoral induit par l'interaction E4orf4-Ba. Ces peptides devraient provoquer ex vivo (cellules transformées) et in vivo, l'apoptose des tumeurs (chez la souris dans un modèle d'hépatocarcinome lié à c-myc). Des études structurales (biacore et co-crystallographie de PP1c avec des peptides dont les séquences correspondent aux sites d'interaction de protéines régulant l'apoptose) devraient permettre de préciser les mécanismes de régulation de la phosphatase et son rôle dans le contrôle de l'apoptose. L'identification de biopeptides pénétrants et la synthèse de peptidomimétiques interagissant avec PP2A pourraient déboucher sur une nouvelle thérapie anti-tumorale.

7. Evolution dirigée d'enzymes

(Jean-Luc Jestin, Pierre-Alexandre Kaminski, Sophie Vichier-Guerre, Stéphane Ferris)

Alors que les stratégies classiques d'évolution dirigée d'enzymes font appel au criblage, nous développons des méthodes de sélection qui permettent d'analyser simultanément l'activité catalytique de plus de 108 protéines distinctes. Les sélections en fonction de l'activité catalytique sont réalisées in vivo en utilisant des souches appropriées de bactéries Escherichia coli et in vitro en utilisant une chimie des Inovirus ou bactériophages filamenteux.

Des ADN-polymérases thermostables dotées d'activités catalytiques de type transcriptase inverse thermostable ont été sélectionnées in vitro. D'autre part, cette stratégie d'ingénierie d'enzymes est appliquée à l'isolement de glycosyltransférases pour faciliter la synthèse de glycoconjugués à potentiel vaccinal. Enfin, des variants de N-désoxyribosyltransférases acceptant des analogues de nucléosides ont été isolés par sélection in vivo.

Au delà des applications de ces nouvelles enzymes, ce sont les relations entre les séquences, les structures et les activités catalytiques de ces enzymes qui présentent un intérêt particulier.

Mots-clés: glycoconjugués, vaccins, peptides, chimiokines, nucléosides hétérodoxes, agents antituberculeux, sélection in vivo d'enzymes, évolution in vitro, nucléoside monophosphate kinases, phosphatases



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Janin, Yves, CNRS (CR1, yljanin@pasteur.fr)

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Kaminski, Pierre-Alexandre, IP (CR, akaminsk@pasteur.fr)

Mulard, Laurence, IP (CR, lmulard@pasteur.fr)

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Pochet, Sylvie, CNRS (DR2, spochet@pasteur.fr)

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Bristeau-Leprince, Post-doc

Cadena Amaro Claudio, Thèse

Dessauge Frédéric, Thèse

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Gasse Cécile, Thèse

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Grandjean Cyrille, Post-doc

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Ferris Stéphane, IP (Technicien Supérieur, sferris@pasteur.fr)

Ganneau Christelle, IP (Technicienne Supérieure, cganneau@pasteur.fr)

Groh François, IP (Technicien Supérieur, fgroh@pasteur.fr)

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Ughetto-Monfrin Joël, CNRS (Ingénieur, ughetto@pasteur.fr)


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