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     Biologie Moléculaire de l'Expression Génique


  Responsable : Israël Alain (aisrael@pasteur.fr)


  resume

 

Les projets du laboratoire portent sur l'étude de deux systèmes de signalisation caractérisés par des événements inductibles de protéolyse, aboutissant au transport nucléaire de facteurs de transcription. Un premier projet concerne la famille de facteurs de transcription rel/NF-κB, dont l'activité est contrôlée par des mécanismes de rétention cytoplasmique impliquant des molécules inhibitrices (appelées IκB) dont la dégradation est induite par une variété de signaux. En collaboration avec l'équipe de Michel Véron nous avons identifié des peptides qui interférent avec l'oligomérisation de la protéine NEMO, le composant central de la voie d'activation NF-κB, et inhibent spécifiquement cette voie.

Un second projet porte sur le récepteur Notch qui transmet un signal à la suite de 3 étapes de protéolyse et du transport nucléaire de sa région intracellulaire. Nos efforts ont porté dans 2 directions. Nous avons d'une part identifié un nouveau mécanisme qui par l'intermédiaire d'une étape de monoubiquitination faisant suite à la seconde étape de protéolyse permet à la troisième d'avoir lieu. D'autre part nous avons montré que la partie intracellulaire des ligands de Notch interagit avec des composants du cytosquelette et modifie la motilité de la cellule exprimant ces ligands. Cette interaction ne semble néammoins pas être impliquée dans la transmission du signal Notch.



  rapport

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Structure de la molécule NEMO et identification de peptides inhibant son oligomérisation (G. Courtois, R. Weil, T. Lopez)

En collaboration avec Fabrice Agou (laboratoire de Michel Veron), nous avons étudié les déterminants de l'oligomérisation de la molécule NEMO. NEMO est la sous-unité régulatrice du complexe IKK, qui comprend aussi les 2 kinases IKKα et IKKβ, et son oligomérisation semble être un événement important de l'activation de ce complexe. L' oligomérisation de NEMO implique la partie C-terminale de la molécule, qui inclut deux régions de type coiled-coil, appelées CC2 et LZ, une région riche en proline et une région C-terminale en doigt de zinc. Nous avons démontré que la région minimale d'oligomérisation de NEMO peut être restreinte aux domaines CC2 et LZ, et que ces deux domaines sont nécessaires au rétablissement de la réponse NF-κB au LPS dans une lignée cellulaire déficiente en NEMO. Nous avons confirmé l'oligomérisation de cette région en trimère, et le rôle des domaines CC2 et LZ dans cet événement. Nous avons aussi montré que après mélange, les domaines CC2 et LZ s'associent pour former un hétéro-hexamère. Nous avons donc proposé un modèle d'organisation du domaine d'oligomérisation de NEMO dans lequel trois domaines C-terminaux s'associent pour former un pseudo-hexamère composé de 6 hélices.

Afin de mettre au point des inhibiteurs spécifiques de la voie NF-κB, nous avons synthétisé des peptides correspondant aux domaines CC2 et LZ, et les avons fusionnés avec le peptide antennapedia/penetratine. Ces peptides ont été introduits dans des cellules avant stimulation par le LPS, et se sont révélés inhiber l'activation de NF-κB avec une IC50 de l'ordre du μm. En outre, ces molécules sont capables d'induire l'apoptose de cellules de rétinoblastome Y79, qui nécessitent une activité NF-κB constitutive pour survivre. Ces résultats représentent un premier pas vers la mise au point de drogues capables d'inhiber spécifiquement l'activation de NF-κB en interférant avec l'oligomérisation de NEMO.

Role de la voie NF-κB dans la differenciation des cellules NK (S. Mémet, D. Ndiaye; collaboration Jim di Santo)

Tandis que des perturbations de la voie NF-κB interférent fortement avec la différenciation des cellules B et T, à peu près rien n'est connu du rôle que joue la voie NF-κB dans la différenciation des cellules NK. Nous avons analysé les conséquences de la déficience en deux membres de la famille IκB, IκBα and IκBε. Alors que la déficience en l'un de ces inhibiteurs n'a pas d'impact sur les cellules NK, l'absence des deux aboutit à une hyperactivation de NF-κB, à un défaut de maturation et une diminution du nombre de cellules NK, et à une absence de production d'interferon γ. L'analyse de souris exprimant une gène rapporteur NF-κB montre une augmentation de cette activité au stade de différenciation des cellules NK correspondant au bloc partiel observé dans les souris double KO. Ces résultats définissent une fenêtre au cours du développement des cellules NK pendant laquelle le contrôle du niveau d'activation de NF-κB est critique.

La voie de signalisation Notch (F. Logeat, C. Brou, N. Gupta, E. Six, A. Olry, P. Chastagner, D. Ndiaye, O. LeBail)

Nous avons proposé un modèle selon lequel l'activation du récepteur Notch implique 3 étapes de maturation protéolytique. La première coupure est dûe à la furine et est nécessaire à l'expression à la membrane d'un récepteur fonctionnel. Une seconde étape de coupure, nécessaire à l'activation, a lieu dans la région extracellulaire de Notch et est dûe à la métalloprotéase TACE. L'étape finale est dûe à une activité nommée γ-secrétase, et aboutit à la libération de la région intracellulaire du récepteur qui est transportée dans le noyau où elle se comporte comme un co-activateur transcriptionnel.

Un de nos projets consiste à caractériser plus en détail l'étape de coupure par la γ-secrétase, et en particulier les divers éléments, cellulaires et moléculaires, qui la contrôlent. Nous avons montré que cette étape de coupure requiert une étape de monoubiquitination de Notch qui suit la coupure par TACE, et est elle-même suivie d'une étape d'endocytose clathrine-dépendante. La préséniline, le composant catalytique du complexe γ-secrétase, interagit préférentiellement avec la forme monoubiquitinée de Notch. Nous avons identifié le résidu Lysine cible de la monoubiquitination et avons confirmé son importance dans l'activation de Notch par son ligand Delta1.

Le second projet vise à caractériser un éventuel rôle cellulaire-autonome des ligands de Notch. Une approche protéomique nous a permis d'identifier la protéine Dlg1 comme partenaire d'interaction de la région C-terminale de Delta1. Dlg1 est l'homologue chez les mammifères de la protéine Discs Large de drosophile, un membre de la famille MAGUK de protéines d'assemblage reliant la membrane plasmique au cytosquelette. Nous avons ensuite montré que la deletion de la séquence C-terminale de Delta1 (ATEV), un site consensus de liaison aux domaines PDZ, abolit cette interaction. Delta4 s ‘associe aussi avec Dlg1, tandis que les membres de la seconde famille de ligands de Notch, Jagged, ne lient pas Dlg1. Dans des cellules HeLa, l'introduction de Delta1 induit la concentration de Dlg1 aux jonctions cellulaires. Dans des cellules 3T3, l'introduction de Delta1 réduit la motilité cellulaire, d'une manière strictement dépendante du motif ATEV. Par contre la délétion de ce motif n'interfère pas avec la capacité de Delta1 d'activer la voie Notch dans des cellules adjacentes, dans un modèle de différenciation hématopoïétique en coculture. Ces résultats suggèrent un rôle probablement cellulaire-autonome des ligands de Notch, qui est indépendant de leur activité en tant que ligand.

Mots-clés: Signalisation, phosphorylation, protéolyse, ubiquitination, NF-?B, Notch



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Marie Dominique Aytac (mdaytac@pasteur.fr) BROU, Christel, Institut Pasteur (chef labo)

COURTOIS, Gilles, INSERM (DR2)

GUPTA-ROSSI, Neetu, Institut Pasteur (CR)

LOGEAT, Frédérique, CNRS (DR2)

MEMET, Sylvie, INSERM (CR1)

WEIL, Robert, CNRS (CR1)

BLAISE, Régis, post-doc

LOBRY, Camille, étudiant thèse

OLRY, Annie, étudiante thèse

HEUSS, Sara, étudiante DEA

SIX, Emmanuelle, étudiante thése

CHASTAGNER, Patricia, technicienne Pasteur

LOPEZ, Tatiana, technicienne Pasteur

NDIAYE, Delphine, AI CNRS

MOURGUIN-NAGUIN Stéphanie, agent de laboratoire


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