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     Biologie Cellulaire du Noyau - URA 2582 CNRS


  Responsable : Bachellier Sophie, Nehrbass Ulf (bachelli@pasteur.fr, nehrbass@pasteur.fr)


  resume

 

Notre laboratoire étudie les relations structure-fonction au sein du noyau, et plus précisément le rôle régulateur de la position des gènes dans l'espace nucléaire. Nous mettons au point des outils pour suivre la localisation -révélée par microscopie confocale (spinning disk) ou en épifluorescence - de loci discrets ou de régions chromosomiques, au cours du temps et en fonction de leur activité transcriptionnelle. Par ailleurs, nous utilisons des rétroéléments afin de définir des sous-domaines chromosomiques fonctionnels.



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Le laboratoire étudie les relations structure-fonction au sein du noyau, en utilisant les deux approches suivantes :

1. Nous étudions l'influence de l'architecture nucléaire sur des mécanismes nucléaires (par exemple la régulation de la transcription).

2. Nous étudions l'utilisation de structures nucléaires par des particules rétrovirales dans le ciblage de sites d'intégration.

1. Analyse stucture-fonction de la régulation transcriptionnelle. (S. Bachellier-Bassi, G. Cabal, B. David-Watine, F. Donnadieu, F. Feuerbach, O. Gadal, M. Mhlanga, A. Romano)

1.1 Rétention périnucléaire des prémessagers.

Mlp1 et Mlp2, deux protéines impliquées dans l'architecture périnucléaire, sont distribuées de façon assymétrique dans la membrane nucléaire. Elles sont exclues de la région de la membrane nucléaire bordant le nucléole et se concentrent dans celle adjacente à la chromatine. Par un crible génétique réalisé en collaboration avec l'Unité de Génétique des Interactions Macromoléculaires, nous avons pu montrer que la protéine Mlp1 est impliquée dans le contôle qualité des ARNm avant leur export, retenant les ARN immatures dans le noyau.

1.2 Un modèle moléculaire pour le "gene gating".

Sachant que l'architecture nucléaire influence la répression transcriptionnelle, nous nous somme demandé si le positionnement spatial d'un gène dans le noyau pouvait aussi jouer un rôle dans l'activation de ce gène. A partir de données suggérant que l'intégrité du domaine périnucléaire chez Saccharomyces cerevisiae est nécessaire à l'activation des gènes de réponse au Cadmium, nous nous sommes concentrés sur l'étude d'un complexe de régulation transcriptionnelle impliqué dans la réponse aux stress, le complexe SAGA. En collaboration avec l'Unité d'Analyse d'Images Quantitative, nous avons mis au point une méthode permettant de suivre un gène, actif ou non, en 3D et au cours du temps. Nous avons ainsi pu suivre la relocalisation vers la périphérie du noyau de gènes lors de leur activation, et montrer que ce phénomène est dépendant de l'interaction du complexe SAGA avec la machinerie d'export des ARNm au niveau des extensions nucléoplasmiques du pore nucléaire. Ces résultats constituent la première preuve de l'existence du phénomène de "gene-gating", dont l'hypothèse avait été formulée pour la première fois il y a 20 ans.

1.3 Contribution des ARNm à la localisation d'un locus transcrit.

Nous étudions la position d'un gène de choc thermique de levure marqué par des répétitions "tetO" (auxquelles se lie spécifiquement la protéine TetR fusionnée à la GFP) par rapport à la périphérie du noyau, révélée par la protéine Mlp1 fusionnée à la GFP. De manière inattendue, la distribution périnucléaire de cette protéine est affectée par le choc thermique : elle se concentre en foyers principalement périphériques, mais parfois à proximité du locus marqué par les répétitions tetO. Nous étudions le possible recrutement de Mlp1 par l'ARN au site même de transcription. Nous avons en effet montré que les protéines Mlp se lient à des ARN ; les expériences en cours suggèrent que les transcrits, via cette interaction, pourraient jouer un rôle dans la localisation du gène transcrit, éventuellement en synergie avec des régulateurs de transcription. Nous poursuivons l'analyse de la relocalisation de Mlp1 à proximité de sites hautement transcrits et son possible lien avec des facteurs de liaison à l'ARN, tels SUB2 et YRA1.

1.4 L'ADNr comme modèle d'étude de la dynamique de la chromatine lors de la régulation des gènes.

Nous avons modifié la région codant les ARN ribosomiques (ADNr) pour permettre son marquage fluorescent. L'observation de ce marquage fluorescent à l'aide d'un microscope confocal (disque de Nipkov), suivie de l'analyse quantitative des images obtenues avec un algorithme de super-résolution, en collaboration avec C. Zimmer (Unité d'Analyse d'Images Quantitative), nous permet d'étudier l'ADNr in vivo en 3D. Nous avons pu montrer qu'un mutant de l'histone déacétylase (sir2?) affecte l'architecture spatiale de l'ADNr marqué. Nous allons étendre cette approche statique en une étude en 3D au cours du temps pour mieux comprendre les liens entre régulation transcriptionelle et dynamique de la chromatine in vivo.

2. Utilisation de retro-éléments comme outils d'analyse des relations structure/fonction du noyau. (A. Boese, F. Feuerbach, P. Sommer)

2.1 Utilisation de retrotransposons pour mettre en évidence des modifications du métabolisme nucléaire.

Dans des cellules déficientes pour les protéines Mlp1 et Mlp2, la fréquence de transposition du rétrotransposon Ty5 est augmentée. Ce phénomène n'est plus observé lorsque la machinerie de recombinaison homologue (RH) est également inactive, suggérant que les protéines Mlp jouent un rôle dans la régulation de la RH. Les études réalisées avec ces triples mutants ont révélé l'existence de deux sous-populations disctintes, dans lesquelles la fréquence de transposition des éléments Ty5, mais aussi Ty1, diffère. Les travaux actuellement poursuivis ont pour but d'essayer de déterminer ce qui différencie ces deux populations ainsi que le rôle des protéines Mlp dans les phénomènes de recombinaison et/ou de réparation de l'ADN.

2.2 Interaction entre le virus VIH et INI1 et son rôle dans la détermination des sites d'intégration du virus.

Ce projet avait pour but initial de déterminer si l'interaction entre l'intégrase du VIH et la protéine INI1 (hSNF5), membre du complexe SWI/SNF de remodelage de la chromatine, favorisait l'intégration de ce virus dans des zones transcriptionnellement actives du génome. Des cellules dans lesquelles l'expression de la protéine INI1 est inhibée de façon transitoire en utilisant la technique d'interférence ARN (RNAi) ont été infectées par un vecteur viral contenant un gène rapporteur sous contrôle du promoteur du VIH. De façon surprenante, la transcription du gène rapporteur est augmentée lorsque la protéine INI1 est absente au moment de l'infection, mais est inhibée lorsque la quantité de cette protéine retrouve son taux normal. Une fois le gène rapporteur (et donc le virus) intégré, l'inhibition de la synthèse de la protéine INI1 par interférence ARN n'a qu'un effet modeste sur le taux d'expression du rapporteur. Cette absence de réversibilité pourrait résulter d'une modification stable de la chromatine inhibant la transcription, puisque nous avons pu mettre en évidence une augmentation de la méthylation des résidus lysine en position 9 de l'histone H3 dans la séquence promotrice du gène rapporteur.

2.3 Corrélation globale entre le potentiel transcriptionnel et la position des virus VIH intégrés.

Le VIH constitue par ailleurs un système très élégant pour corréler la position d'un locus dans le noyau à un potentiel transcriptionnel. Nous avons établi des lignées cellulaires après transduction par un vecteur viral contenant un gène rapporteur sous contrôle du promoteur du VIH, et séquencé les sites d'intégration. La position du VIH par rapport aux territoires chromosomiques sera analysée par FISH dans des clones présentant différents niveaux d'expression du rapporteur, et qui répondent différemment à l'activation tat. Ce travail permettra de déterminer s'il existe une corrélation entre les niveaux d'expression des gènes rapporteurs et leur intégration dans des sous-domaines fonctionnels spécifiques. Il nous permettra également d'étudier l'effet de l'intégration du VIH sur les changements de position du locus d'intégration.

3 L'actine et les mouvements du noyau. (S. Münter)

Un noyau est un espace compartimentalisé qui, pour être fonctionnel, doit permettre une certaine forme de communication entre ces compartiments. Dans un environnement où la localisation dans l'espace nucléaire porte une information fonctionnelle, les mouvements entre ces compartiments pourraient avoir une fonction régulatrice. L'actine, dont la forme monomérique est associée aux noyaux, ainsi que les protéines ARP, ont été impliquées dans de nombreux mécanismes nucléaires, tels le remodelage de la chromatine et l'activation transcriptionnelle. Nous avons étudié l'effet de la polymérisation de l'actine dans la locomotion nucléaire. Nous avons observé, par imagerie confocale sur cellules vivantes suivie d'analyse d'images, que des monomères d'actine fluorescente micro-injectés dans les cellules s'accumulent et forment un anneau autour de l'enveloppe nucléaire en quelques minutes. Cet anneau d'actine présent autour de l'enveloppe nucléaire est également révélé par le CD-BODIPY, un analogue fluorescent de la cytochalasine D. Nous avons détecté l'actine fluorescente et le CD-BODIPY à l'intérieur d'invaginations profondes de la membrane nucléaire. Par ailleurs, in vitro, des enveloppes nucléaires isolées stimulent la polymérisation de l'actine, qui est inhibée en présence d'anticorps dirigés contre les nucléoporines.

Mots-clés: architecture nucléaire, régulation de l'expression des gènes



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Dulieu, Isabelle, idulieu@pasteur.fr Bachellier-Bassi, Sophie, IP, (CR, bachelli@pasteur.fr)

David-Watine, Brigitte, INSERM, (CR1, bdwati@pasteur.fr)

Feuerbach-Fournier, Frank, IP, (CR, ffeuerba@pasteur.fr)

Gadal, Olivier, CNRS, (CR2, ogadal@pasteur.fr)

Boese, Annette, Postdoc

Cabal, Ghislain, Etudiant en thèse

Mhlanga, Musa, Postdoc

Münter, Sylvia, Postdoc

Romano, Alper, Postdoc

Sommer, Peter, Postdoc

Donnadieu, Françoise, (ITA, fdonna@pasteur.fr)

Doualot, Harry, (ITA, hdoualot@pasteur.fr)


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