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     Bactéries anaérobies et Toxines


  Responsable : Popoff Michel R. (mpopoff@pasteur.fr)


  resume

 

Régulation de la toxinogénèse chez Clostridium botulinum et Clostridium tetani; évidence que BotR/A et TetR sont des facteurs sigma alternatifs contrôlant l'expression des gènes de la neurotoxine et des protéines associées. Immunogénicité de la neurotoxine botulique. Etude des toxines clostridiennes de grande taille qui glucosylent des Rho et Ras GTPases; voies de signalisation impliquées dans le contrôle de la polymérisation de l'actine et des jonction intercellulaires. Structure de la toxine epsilon de Clostridium perfringens.

Le CNR Bactéries anaérobies et botulisme est impliqué dans la surveillance du botulisme et l'identification des souches de bactéries anaérobies (voir CNR bactéries anaérobies et botulisme).



  rapport

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Bot R/A et TetR sont des facteurs sigma alternatifs contrôlant l'expression des gènes de la neurotoxine et des protéines associées chez Clostridium botulinum A et Clostridium tetani

Clostridium botulinum et Clostridium tetani produisent de puissantes toxines, la neurotoxine botulique (BoNT) et la toxine tétanique (TeTx), respectivement, qui sont responsables de maladies sévères, le botulisme et le tétanos<. La synthèse de neurotoxine st une processus régulé chez Clostridium. Les gènes botR/A chez C. botulinum A et tetR chez C. tetani régulent positivement l'expression des gènes codant pour BoNT/A et les protéines non toxiques associées (ANTPs), ainsi que TeTx respectivement. Le gène botR/A est loclaisé à proximité de deux opérons qui contiennent les gènes bont/A et antps chez C. botyulinum A, et tetR précède immédiatement le gène tetx chez C. tetani. Nous avons montré que BotR/A et TetR agissent comme desf acteurs digma alternatifs plutot que comme des régulateurs positifs d'après les résultats suivants: i) BotR/A et TetR s'associent à l'ADN cible seulement en présence du core enzyme de de la RNA polymerase (Core); ii) BotR/A et TetR se fixent sur le core enzyme; iii) BotR/A-Core reconnaît les régions –35 et –10 du proomoter ntnh-bont/A, at iv) BotR/A et TetR stimulent la transcription in vitro des promoters cibles. Chez C. botulinum A, les gènes bont/A et antps sont transcrits commes des opréons bi- et tri-cistroniques sous le contrôle de BotR/A. BotR/A et TetR sont certainement apparentés à un nouveau de facteurs sigma de la famille &σ 70 qui inclue TcdR et UviA, qui régulent respectivement la production des toxines A et B de C. difficile et et une bactériocine chez C. perfringens. Les séquences des régions –35 sont hautement conservées dans les promoteurs des gènes cibles des toxines chez C. botulinum, C. tetani, C. difficile et C. perfringens. Ainsi, un mécanisme commun de régulation contrôle probablement l'expression des gènes de toxines chez ces quatre espèces de Clostridium.

L'interaction entre les deux sous-domaines de la partie C-terminale de la neurotoxine botulique A sont essentiels pour l'induction d'anticorps neutralisants

Le fragment C-terminal (Hc) de la neurotoxine botulique A qui est implique dans la liaison de la toxine avec les récepteurs à la surface des neurones, est constitué de deux sous domaines, Hc-N (acides aminés 873-1095) et HcC (acides aminés 1096-1296). Dans le but de définir le fragment minimal de Hc qui porte les épitopes protecteurs, Hc, Hc-N et Hc-C ont été produits en tant que protéine recombinante chez Escherichia coli, et ont été testés pour leur antigénicité dans des essais de protection chez la souris. Hc, Hc-N et Hc-C induisent une réponse identique en anticorps mesurés par ELISA. Cependant, une simple immunisation avec Hc (10 μg) protége complétement les souris éprouvées avec 103 doses létales de neurotoxine botulique A, tandis que Hc-N,t Hc-C, ou Hc-N plus Hc-C n'ont pas produit de protection. Des triples immunisations avec Hc-N ou Hc-C ont été nécessaires pour induire un niveau élevé de protection. Les analyses par dichroisme circulaire et fluorescence ont montré que les sous domaines recombinants étaient structurés et stables. Cependant, un intense signal en UV proche et en dichroisme circulaire a été observé seulement dans le spectre de Hc, révélant une interface hautement structurée entre les deux sous domaines. Ces résultats montrent que l'induction d'anticorps protecteurs requiert le domaine Hc entier et plus spécialement la structure native de la région interfaciale entre les sous domaines Hc-N et Hc-C.

Un site de liaison à la phosphatidylsérine dans le fragment cytosolique de la toxine létlae de Clostridium sordellii facilite la glucosylation de Rac lié à la membraneB

Les toxines clostridiennes de grande taille glucosylent cetaines petites GTPases sur un résidu thréonine, ainsi empêchant leur interaction avec leurs effecteurs. Nous avons montré que le domaine glucosyltransferase de la toxine letale (LT) de Clostridium sordellii (LTcyt acides aminés 1-546), qui est relargué dans le cytosol durant l'intoxication, se lie ;préférentiellement aux liposomes contenant de la phosphatidylsérine comparé aux autres lipides anioniques. La liaison de Ltcyt à la phosphatidylsérine augmente d'une magnitude deux ordres le taux de glucosylation de liposomes couplés à Rac-GDP-géranyl-géranyl. Une étude par protéolyse ménagée et troncation a montré que le site de liaison à la phosphatidylsérine est localisé dans les 18 acides aminés N-terminaux de Ltcyt. La délétion de ces résidus abolit l'effet de la phosphatidylsérine sur l'activité de Ltcyt sur les liposomes couplés à Rac-GDP-géranyl-géranyl. En conclusion, l'avidité de Ltcyt pour la phosphatidylsérine facilité sa liaison sur le feuilleet cytosolique des membranes cellulaires plus spécialement de la membrane plasmique, où ce lipide anionique est abondant et où sont localisés plusieurs cibles de la toxine LT.

Dégénération et régénération des jonctions neuromusculaires squelettiques de souris après injection intramusculaire de dose sublétale de toxine létale de Clostridium sordellii

La toxine létale de Clostridium sordellii (LT) qui est le facteur majeur de virulence de cette bactérie, appartient à la famille des toxines clostridiennes de grande taille qui glucosylent des petites GTPases. Nous avons analysé ex vivo la structure et la fonction du tissu neuromusculaire squelettique de souris après injection intramusculaire de dose sublétale (0,25 ng/g) de LT. En 24h, LT a induit un œdème localisé et sévère, inflammation, désassemblage des myofibrilles, et dégénération des fibres musculaires squelettiques dans la zone d'injection, et la glucosylation des petites GTPases du tissu musculaire. La régénération des fibres musculaires endommagées était évidente 6 à 9 jours après injection et était complète après 60 jours. L'expression de dystrophine, laminine, ainsi que de la myosine néonatale et rapide détectée par microscopie en immunofluorescence dans les fibres en régénérescence, a confirmé que LT n'altère pas la capacité de régénération des fibres musculaires de souris. Une étude fonctionnelle a révélé que LT affecte la contractilité musculaire et la transmission neuro-musculaire. Cependant, une guérison partielle de la transmission neuro-musculaire a été observée 15 jours après injection et un remodelage important des jonctions neuro-musculaires et un regroupement des récepteurs musculaires à l'acétylcholine étaient encore évidents 30 jours après injection. En conclusion, ceci est le premier rapport caractérisant une dégénération régénération du tissu neuromusculaire squelettique après exposition in vivo à une toxine clostridienne de grande taille. De plus, nos données procurent une explication aux altérations sévères du tissu neuromusculaire qui accompagnent les infections de plaies par C. sordellii.

La toxine espilon de Clostridium perfringens montre une structure similaire à celle de l'aérolysine, une toxine formant des pores

La toxine epsilon de Clostridium perfringens est une toxine létale. Des études récentes montrent que cette toxine agît par un mécanisme particulier de formation de pores. Nous avons déterminé la structure cristallographique de la toxine epsilon, qui révèle une structure similaire à celle de l'aérolysine de Aeromonas hydrophila. Les toxines qui forment de pores changent de conformation entre un état soluble et transmembranaire. En comparant les deux toxines, nous avons identifié les régions importantes pour cette transformation.

Photo 1. Représentation d'une section transversale du muscle tibialis anterior coloré avec l'hématoxline et l'éosine, à différents temps après injection intramusculaire d'une dose sublétale de LT. Noter la présence de fibres nécrotiques (astérique) et d'in infiltrat inflammatoire abondant (flèche) 3 jours après injection. Des petits myocytes en régénération et des noyaux centraux (pointe de flèche) sont évidents9 et 17 jours après injection, mais les fibres nécrotiques et le tissu conjonctif ne sont pas présents, et les muscles squelettiques possèdent de grandes fibres en cours de régénération avec des noyaux centraux 17 et 30 jours après injection.

Photo 2. Structure de la toxine epsilon de Clostridium perfringens et de l'aérolysine avec identification des domaines. Diagramme en ruban de la toxine epsilon (a) et de l'aérolysine (b), N-terminus coloré en rouge et C-terminus en bleu. Des boucles et hélices supplémentaires dans l'aérolysine sont en gris et la région qui s'insère probablement dans la membrane est en rouge foncé. La structure de la toxine epsilon a été déposée dans Protein Data Bank (accession code IUYJ).

Mots-clés: Clostridium, botulisme, toxines, Rho-GTPases, cytosquelette, actine



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