Unité: Virus Lents - CNRS URA 1930

Responsable: BRAHIC Michel

L'Unité a deux grands domaines d'activité : la neurovirologie et le SIDA. Nous étudions la pathogénie de la maladie de la souris due au virus de Theiler et de la maladie du rat due au virus de Borna. En ce qui concerne le SIDA, nous tentons de développer un vaccin basé sur la souche Schwarz du virus de la rougeole, et nous étudions la maturation thymique des cellules T au cours des temps précoces de l'infection par HIV/SIV.

1- Pathogénie de l'infection par le virus de Theiler (Michel Brahic, Jean-François Bureau)

Le virus de Theiler, un picornavirus, infecte le système nerveux central (SNC) de la souris de façon persistante. Le virus persiste dans les cellules gliales de la substance blanche de la moelle épinière, en particulier les oligodendrocytes et les macrophages infiltrants. L'infection s'accompagne d'inflammation chronique et de lésions démyélinisantes qui ressemblent de près aux plaques actives de malades atteints de sclérose en plaques.

Le virus infecte initialement les neurones, mais il persiste dans les cellules gliales. Nous étudions le trafic du virus entre ces différentes cellules avec des approches génétiques et de biologie cellulaire, en particulier des cultures mixtes de neurones et oligodendrocytes qui myélinisent in vitro. Les souris C3H shiverer et rumpshaker, porteuses de mutations dans deux protéines de structure de la myéline (MBP et PLP), sont résistantes à l'infection persistante, suggérant que l'oligodendrocyte et/ou la myéline joue(nt) un rôle clé dans la persistance. In vitro, les oligodendrocytes des souris C3H et mutantes ont la même permissivité au virus. La résistance n'est donc pas due à un défaut de réplication du virus dans le corps cellulaire de l'oligodendrocyte. Elle pourrait être liée aux anomalies structurales de la myéline des souris mutantes, ou à des altérations de l'interaction virus/macrophage car MBP et PLP sont exprimées, à des taux très faibles, par les macrophages.

La sensibilité à la maladie induite par le virus de Theiler est multigénique. Les différences de sensibilité sont principalement liées au contrôle de la charge virale par le système immunitaire au cours de l'infection persistante. Tmevp3 est un locus de sensibilité que nous avons identifié sur le chromosome 10 et qui fait partie d'un groupe de gènes de cytokines, dont l'interféron gamma et l'IL-Tif/IL-22. Aucun polymorphisme fonctionnel n'a été trouvé dans ces gènes de cytokines, ce qui suggère que Tmevp3 en régule l'expression. Tmevpg1, un gène codant pour un ARN non-codant exprimé dans les lymphocytes T est un candidat pour le locus Tmevp3. Nous étudions le rôle du locus humain homologue dans la sclérose en plaques. Les résultats suggèrent un effet faible de la région.

2- Pathologie neuronale due au Bornavirus (Daniel Gonzalez-Dunia)

Le Bornavirus (BDV), un virus à ARN négatif simple brin non segmenté, infecte le SNC de nombreux mammifères de façon persistante et induit des troubles du comportement. Le BDV infecte l'homme et il a été suggéré qu'il pourrait être impliqué dans l'étiologie de certaines maladies psychiatriques. Le virus infecte principalement les neurones sans être cytopathique, et sans induire d'inflammation quand les animaux sont infectés à la naissance. Par contre, cette infection persistante est responsable de troubles du fonctionnement neuronal. Notre objectif est d'élucider les mécanismes par lesquels le virus interfère avec la neuroplasticité et le fonctionnement neuronal.

Nous avons étudié l'effet du virus sur des cultures primaires de neurones d'hippocampe de rat, la cible principale du BDV. Les neurones sont très permissifs. L'infection n'altère ni leur survie, ni leur morphologie, ni l'expression de marqueurs structuraux spécifiques. Par contre, elle entraîne une baisse sélective de l'expression de protéines impliquées dans le remodelage et la plasticité synaptiques, telles que GAP-43, la synapsine, VAMP-2 et la synaptophysine. De plus, la synaptogénèse induite par les neurotrophines BDNF et NT3 est abolie dans les neurones infectés, à la suite d'un défaut de phosphorylation de la kinase ERK1/2. Au niveau fonctionnel, une étude récente suggère que le virus interfère avec les mécanismes de potentialisation synaptique.

Nous avons observé que le 1-ß-D-arabinofuranosylcytosine (Ara-C), bloque la réplication du BDV, in vivo et in vitro. D'autres molécules aussi actives mais moins toxiques ont été identifiées dont le 2'-Fluoro-2'-déoxycytidine (2-FdC). Le 2-FdC est un agent prometteur pour une chimiothérapie anti-BDV.

3- Mise au point de vaccins bivalents dérivés du vaccin contre la rougeole (Frédéric Tangy)

Les souches atténuées du virus de la rougeole sont des vaccins très efficaces et très sûrs qui peuvent être transformés en vecteurs pour exprimer des gènes étrangers. Nous utilisons ces vecteurs pour tenter de mettre au point un vaccin vaccin pédiatrique bivalent contre la rougeole et le VIH.

La souche vaccinale Schwarz a été clonée et transformée en vecteur par addition de deux unités de transcription supplémentaires. Des vaccins recombinants exprimant différentes formes des protéines Gag, Pol et Nef du VIS, Env et Tat du VIH ont été construits. Ils induisent de fortes réponses humorales et cellulaires contre les protéines VIS et VIH chez des souris transgéniques pour le récepteur de la rougeole.

Les boucles hypervariables V1, V2 et V3 du gène env du VIH 89.6 ont été délétées isolément ou dans différentes combinaisons, et introduites dans le vecteur rougeole. Ces constructions induisent des réponses T et des anticorps neutralisants après une seule injection à des souris transgéniques. Les sérums neutralisent 90-100 % de l'infectivité d'isolats primaires du VIH à la dilution 1/100. Ces taux sont supérieurs à ceux de sérums humains neutralisants de référence. Après 2 injections, les taux d'anticorps anti-VIH sont comparables, que les souris soient naïves ou pré-immunisées contre la rougeole. Le même résultat a été obtenu chez des singes macaques un an après la pré-immunisation contre la rougeole. Ces résultats indiquent que des vaccins rougeole recombinants pourraient être utilisés chez des individus possédant déjà une immunité anti-rougeole.

Une expérience d'immunisation/épreuve est en cours chez 18 macaques avec un mélange de vecteurs rougeole exprimant les protéines Gag, Env, Tat, Nef du virus chimérique SHIV89,6. De fortes réponses cellulaires ont été obtenues chez tous les singes, et des anticorps neutralisants chez certains d'entre eux.

4- Fonction thymique au cours de la primo-infection par le VIH/SIV (Rémi Cheynier)

Le thymus joue un rôle majeur dans l'homéostasie des populations T naïves de l'adulte et dans les processus de reconstitution immunitaires, au cours de l'infection par le VIH-1 en particulier après tri-thérapie. Nous avons mis au point une méthode originale pour quantifier les cellules récemment émigrées du thymus. Nous avons montré que la thymopïèse était massivement inhibée au cours de la primo-infection, en particulier chez les patients jeunes, et était partiellement restaurée par les traitements antiviraux. Par contre, une augmentation de la thymopoïèse est observée chez les patients lymphopéniques infectés par le VIH-2, qui est moins pathogène, suggérant qu'il devrait être possible de stimuler des mécanismes compensatoires pour compenser la chute des cellules T chez les malades.

Nous analysons la régulation de la fonction thymique chez le macaque infecté par le VIS pour identifier les mécanismes responsables de la diminution de l'export thymique et ceux impliqués dans la reconstitution de cet export au cours des traitements. Ces expériences devraient permettre d'identifier des facteurs qui pourraient être manipulés pour reconstituer un répertoire de cellules T naïves chez les patients.

Photo 1

Myélinisation des axones in vitro. Les neurones et leurs axones ont été colorés en vert avec un anticorps anti-Neurofilament Smi31. Les oligodendrocytes et la myéline ont été colorés en rouge avec un anticorps spécifique de la protéine protéolipidique (PLP). Plusieurs axones sont entourés d'une gaine de myéline sur une partie de leur longueur.

Photo 2

Le Bornavirus bloque la synaptogenèse induite par le traitement au BDNF dans des cultures primaires de neurones d'hippocampe de rat. Des neurones contrôles ou infectés par le Bornavirus ont été traités ou non par la neurotrophine BDNF. La présence de synapses est révélée par immunofluorescence en utilisant un marqueur présynaptique, VAMP-2 (en vert) et un marqueur postsynaptique, PSD-95 (en rouge). L'induction de la formation de synapses par le traitement au BDNF est clairement visible dans les neurones contrôles (comparer les deux photos supérieures). Elle est en revanche bloquée dans les neurones infectés par le BDV.

Photo 3

Virus de la rougeole (souche vaccinale Schwarz) exprimant les protéines d'enveloppe du HIV

Mots-clés: Virus de Theiler, Bornavirus, Vaccin anti-VIH, Virus neurotropes, Thymus, Pathogénie


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