Unité: Biologie des Interactions Cellulaires - CNRS URA 2582

Responsable: DAUTRY-VARSAT Alice

Les travaux de l'unité portent sur : 1) l'endocytose, le trafic intracellulaire et la signalisation de récepteurs membranaires du système immunitaire ; 2) les mécanismes d'entrée et de développement de Chlamydia, bactéries intracellulaires responsables principalement de pneumopathies, de maladies sexuellement transmises et de cécités.

Les cellules communiquent avec leur environnement par l'intermédiaire de récepteurs membranaires qui reconnaissent des composés à l'extérieur de la cellule. La liaison de certaines molécules à leurs récepteurs membranaires spécifiques peut induire un signal intracellulaire et permettre l'entrée de ces molécules et des récepteurs. Dans la plupart des cas, l'entrée se fait dans des compartiments intracellulaires délimités par des membranes. Ensuite, les récepteurs et leurs ligands sont triés vers une destination intracellulaire, la dégradation ou le recyclage vers la membrane plasmique.

Les travaux de l'unité sont consacrés à l'étude de l'entrée, du devenir et du tri intracellulaire vers les compartiments membranaires des cellules eucaryotes de récepteurs membranaires et également de bactéries, les Chlamydia, qui se développent à l'intérieur de leurs cellules hôtes.

Les récepteurs étudiés sont des récepteurs de lymphocytes, importants pour la réponse immune : récepteur à l'antigène des lymphocytes T et récepteurs d'une cytokine, l'interleukine 2 (IL2).

Les Chlamydia sont, selon les souches, responsables de maladies sexuellement transmises, de cécités, d'infections pulmonaires et pourraient être impliquées dans l'athérosclérose. Nous étudions leur voie d'entrée et leur développement dans les cellules hôtes.

1. DYNAMIQUE DES RECEPTEURS ET TRAFIC INTRACELLULAIRE (A. Alcover, A. Dautry-Varsat, F. Gesbert, N. Sauvonnet, S. Charrin, V. Das, M. I. Thoulouze)

Les récepteurs membranaires reconnaissent leur ligand extracellulaire et cette interaction est suivie d'un regroupement de récepteurs à la membrane puis de l'endocytose du complexe ligand-récepteur. Les récepteurs et ligands sont alors soumis à différentes étapes de tri dans les compartiments membranaires. Par ailleurs, les processus d'endocytose conduisent à des modifications d'expression, de fonction et de localisation des composants membranaires.

Les voies d'endocytose

L'endocytose par récepteur permet aux cellules de communiquer avec leur environnement par l'intermédiaire de récepteurs membranaires qui captent diverses macromolécules biologiques importantes présentes dans le milieu extra-cellulaire. Ce processus est essentiel pour l'homéostasie de la cellule puisqu'il contrôle des fonctions aussi diverses que l'apport spécifique de nutriments, la réponse cellulaire aux hormones et autres facteurs de croissance, la capture des antigènes par les cellules présentatrices et l'entrée de certains pathogènes.

Le mécanisme d'endocytose le mieux connu est celui qui implique d'abord la localisation des récepteurs dans des régions particulières de la membrane plasmique, les puits recouverts de clathrine. Ceux-ci se creusent pour former des vésicules recouvertes qui bourgeonnent à partir de la membrane puis perdent rapidement leur manteau de clathrine. Ces vésicules qui transportent les complexes récepteur-ligand fusionnent ensuite avec des compartiments membranaires intracellulaires, les endosomes.

Cependant, il apparaît depuis quelques années qu'il existe d'autres voies d'entrée dans les cellules. Nous avons identifié l'interleukine 2 (IL2) comme le premier ligand physiologique internalisé dans les lymphocytes par une nouvelle voie d'endocytose indépendante de la clathrine. L'endocytose des récepteurs de l'IL2 par cette voie est rapide et efficace.

Les récepteurs de l'IL2 sont associés de façon constitutive à des microdomaines membranaires riches en cholestérol et en glycosphingolipides, appelés "rafts". Après internalisation, ils sont encore dans des microdomaines lipidiques dans les endosomes. Recherchant la régulation moléculaire de cette nouvelle voie d'endocytose, nous avons montré que les petites GTPases de la famille Rho contrôlent spécifiquement la voie indépendante de la clathrine tandis que la GTPase dynamine est impliquée dans la régulation des voies dépendantes et indépendantes de la clathrine.

Les données récentes suggèrent qu'il existe peut-être plusieurs voies d'endocytose indépendantes de la clathrine. Les mécanismes impliqués ainsi que la régulation de ces différentes voies ne sont pas connues. Nous recherchons particulièrement le rôle du cytosquelette d'actine dans la voie d'endocytose des récepteurs de l'IL2.

Le tri intracellulaire des récepteurs internalisés : rôle de l'ubiquitination

Après avoir atteint les endosomes, les récepteurs de l'IL2 sont triés pour être acheminés vers les lysosomes où ils sont dégradés. Une courte séquence de la chaine βdu récepteur de l'IL2 est responsable de son orientation vers les lysosomes et lorsqu'elle est greffée sur une autre protéine membranaire, elle est suffisante pour l'orienter vers les lysosomes. Elle constitue donc un signal de tri. Nous avons observé que l'ubiquitination joue un rôle clé dans le tri des récepteurs vers les endosomes tardifs/lysosomes. En conséquence, les mécanismes d'ubiquitination contrôlent la dégradation des récepteurs. Ceci montre que le système d'ubiquitination, en plus de son rôle établi pour la dégradation par le protéasome des protéines nucléaires et cytosoliques, intervient dans le tri intracellulaire de récepteurs contrôlant ainsi leur expression à la surface. Nous étudions les molécules impliquées dans l'ubiquitination des récepteurs. Nous analysons également les mécanismes pouvant réguler cette ubiquitination.

Polarisation du récepteur à l'antigène des lymphocytes T et formation de la "synapse immunologique": rôle du cytosquelette d'actine et du trafic vésiculaire intracellulaire.

Une étape fondamentale de la réponse immune est la reconnaissance par les lymphocytes T des antigènes exposés à la surface de cellules présentatrices d'antigène. Cette reconnaissance est suivie d'une réorganisation de la membrane plasmique et du cytosquelette sous-jacent. Il se forme alors entre les lymphocytes T et les cellules présentatrices d'antigène un contact étroit qu'on appelle "synapse immunologique", par analogie avec la synapse neuronale. La synapse immunologique est caractérisée par une accumulation polarisée, puis une relocalisation ordonnée, de récepteurs à l'antigène des lymphocytes T (récepteurs T), de molécules d'adhérence, de cytosquelette et de signalisation cellulaire. Il a été proposé que la synapse immunologique module la transmission du signal d'activation aux lymphocytes T. Nous étudions les mécanismes de formation de cette synapse ainsi que ses fonctions, plus particulièrement le rôle du cytosquelette d'actine et du trafic intracellulaire.

Nous avons observé par microscopie confocale une forte réorganisation du cytosquelette d'actine à la jonction entre le lymphocyte T et la cellule présentatrice. Les fibres d'actine couvrent transitoirement une zone importante de cette jonction. L'ezrine, une protéine qui établit des liens entre la membrane plasmique et le cytosquelette d'actine, se concentre aussi à la jonction entre la cellule T et la cellule présentatrice d'antigène (Figure 1), indiquant qu'elle est impliquée dans la réorganisation du cytosquelette induite par l'activation antigénique.

Nous avons recherché la fonction de l'ezrine dans la réponse des lymphocytes T à l'aide de mutants dominants négatifs de l'ezrine. Nous avons montré par microscopie confocale et analyse d'images quantitative que la sur-expression d'un mutant dominant négatif inhibe le rassemblement ("clustering") des récepteurs T à la jonction avec la cellule présentatrice d'antigène. De plus, ce mutant dominant négatif de l'ezrine inhibe l'accumulation de la protéine kinase C (PKC)theta, une molécule importante pour la transmission du signal d'activation des lymphocytes T. Enfin, nous avons montré que la sur-expression de ce mutant d'ezrine inhibe des étapes ultérieures de l'activation des lymphocytes T. Ces résultats nous ont permis de proposer un nouveau rôle pour l'ezrine dans les lymphocytes T. Grâce à sa capacité de relier des composants membranaires au cytosquelette d'actine, l'ezrine faciliterait la relocalisation à la synapse immunologique de récepteurs et de molécules de signalisation, renforçant donc le mécanisme d'activation des lymphocytes T.

Nous étudions également, par microscopie confocale, microscopie dynamique et analyse d'image quantitative, le rôle du trafic vésiculaire intracellulaire dans la formation de la synapse immune. Nous avons montré, que le compartiment d'endocytose précoce et recyclage du lymphocyte T se polarise vers la cellule présentatrice d'antigène suite à la reconnaissance antigénique. Des vésicules d'endocytose sont ainsi acheminées vers la zone de contact cellulaire et recyclent de façon préférentielle à la synapse immune. Ce transport vésiculaire polarisé facilite l'accumulation à la synapse immune de récepteurs membranaires qui suivent des cycles d'endocytose et recyclage, comme le récepteur T. Ainsi, nous avons montré que la perturbation de la polarisation cellulaire, ou du trafic intracellulaire d'endocytose-recyclage du récepteur T, par des approches pharmacologiques ou biologiques, diminue le taux d'accumulation du récepteur à la synapse immune. Nous proposons que le transport intracellulaire est un des mécanismes de polarisation du récepteur T à la synapse immune.

2. Invasion DES CELLULES par Des bactéries INTRACELLULAIRES, LES Chlamydia(A. Dautry-Varsat, A. Subtil, M. E. Balañá, C. Delevoye, B. Wyplosz)

Les bactéries Chlamydia se développent exclusivement à l'intérieur d'une cellule-hôte. Trois espèces sont pathogènes pour l'homme et sont responsables essentiellement de pneumopathies, de maladies sexuellement transmissibles et du trachome. Les bactéries se multiplient dans un compartiment membranaire appelé inclusion, d'où elles sont capables de détourner à leur bénéfice les fonctions des cellules épithéliales qu'elles infectent. Les infections primaires sont très souvent relativement mineures, voire asymptomatiques. Les séquelles, cécité, stérilité, grossesse extra-utérine, apparaissent longtemps après l'infection. Tout le cycle intracellulaire des Chlamydia a lieu dans une vacuole délimitée par une membrane dans laquelle elles se différencient et prolifèrent (Figure 2). A la fin de ce cycle, la cellule est lysée et des formes infectieuses des bactéries sont libérées. Nous étudions les mécanismes par lesquels ces bactéries entrent dans les cellules, s'y développent et modifient les cellules-hôtes.

Le développement des Chlamydia dépend de leur aptitude à entrer dans les cellules, en particulier épithéliales, qui constituent leur cible principale. Grâce aux mutants dominants négatifs de la protéine Eps15 que nous avions obtenus précédemment,  nous avons montré que l'entrée des Chlamydia n'implique pas la voie d'entrée des puits recouverts de clathrine. De plus, la cytochalasine D, dépolymérisant du cytosquelette d'actine, inhibe l'entrée des trois espèces de Chlamydia. Ces données indiquent que l'entrée de Chlamydia s'apparente plutôt à un phénomène de phagocytose, bien qu'elle ait lieu dans des cellules épithéliales (Figure 3). Nous analysons le rôle du cytosquelette d'actine dans l'entrée des bactéries.

Nous avons montré l'implication de microdomaines membranaires riches en cholestérol et sphingolipides (ou "rafts ") dans l'entrée de Chlamydia. En effet, les bactéries se concentrent dans ces domaines membranaires, à la surface cellulaire. De plus, si l'on perturbe la formation de ces microdomaines, on empêche l'entrée des bactéries dans les cellules. Enfin, lorsqu'elles sont à l'intérieur des cellules dans les inclusions, les Chlamydia sont encore dans des microdomaines lipidiques. Ce mécanisme d'entrée pourrait expliquer pourquoi il n'a pas été trouvé dans l'inclusion de marqueurs d'endocytose classiques. Il pourrait également expliquer certaines propriétés de l'inclusion, qui semble interagir par trafic vésiculaire avec la voie de sécrétion et non avec celle d'endocytose.

L'inclusion est un compartiment membranaire dont la taille augmente très rapidement au cours de l'infection (Figure 4). Cette membrane contient des lipides qui proviennent de la cellule-hôte. Elle reçoit également des protéines qui proviennent des bactéries qui prolifèrent à l'intérieur de l'inclusion. Nous avons démontré que les Chlamydia utilisent un système de sécrétion commun à différentes bactéries pathogènes pour sécréter des protéines à travers la membrane de l'inclusion. Nous développons actuellement une approche systématique pour rechercher les protéines sécrétées par ce type de mécanisme (dit de type III) dans la cellule-hôte au cours de l'infection. Nous avons identifié plusieurs protéines candidates dont la caractérisation est en cours. Il est très probable que ces protéines jouent un rôle important dans la pathogénicité des Chlamydia.

Légendes :

Figure 1.Lymphocyte T humain (Tc) interagissant avec une cellule qui présente un superantigène bactérien (APC). On observe par microscopie confocale l'ezrine, protéine associée au cytosquelette d'actine (rouge) et le récepteur à l'antigène du lymphocyte T (vert) qui sont polarisés vers la cellule présentatrice d'antigène (immunofluorescence ; figure de droite). A gauche, on observe la morphologie de ces deux cellules par contraste interférentiel.

Figure 2. Schéma du cycle de développement de Chlamydia. L'intégralité du cycle se déroule dans une cellule-hôte, en 48 à 72 heures. La forme infectieuse (EB) se différencie en forme proliférative (RB) qui se multiplie puis se différencie en EB en fin de cycle.

Figure 3. Chlamydia liée à la surface d'une cellule épithéliale observée en microscopie électronique à balayage. Les bactéries sont marquées avec des anticorps couplés à des billes d'or (points blancs sur la photo). Source : M. E. Balañá, avec M. C. Prévost et S. Giroux, (plate-forme de microscopie électronique, Institut Pasteur).

Figure 4. Schéma des interactions entre les bactéries et les cellules hôtes épitheliales.

L'attachement aux cellules implique des microdomaines membranaires. Le cytosquelette d'actine est réorganisé et les bactéries entrent par phagocytose, ce qui s'accompagne de signalisation dans la cellule. Le mécanisme de sécrétion de type III se met rapidement en place. Les protéines Inc (triangles) qui sont à la membrane de l'inclusion sont des candidats intéressants qui pourraient être impliquées dans divers processus tels que: l'inhibition de la fusion de l'inclusion avec les lysosomes, la migration de l'inclusion le long des microtubules vers le centrosome, l'importation de nutriments et de lipides en provenance de la cellule hôte. D'autres protéines bactériennes sont sécrétées vers le cytosol (étoiles).

Mots-clés: Endocytose, trafic intracellulaire, récepteur de l'interleukine 2, récepteur à l'antigène des lymphocytes T, ezrine, cytosquelette d'actine, synapse immunologique, Chlamydia, sécrétion bactérienne de type III


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