Unité: Toxines et Pathogénie Bactérienne - URA 2172 du CNRS

Responsable: Michèle MOCK

Bacillus anthracis est l'agent de la maladie du charbon. La virulence de B. anthracis nécessite simultanément la synthèse de toxines et la formation d'une capsule. Les recherches portent sur : le des toxines au cours de l'infection, leur mode d'action cellulaire, la contribution des structures de surface de la spore et de la bactérie dans l'interaction de ce pathogène avec l'hôte. Dans le domaine de la vaccination anti-charbonneuse, une composition vaccinale efficace, à usage humain, a été mise au point. Les mécanismes de protection impliqués sont analysés.

La surface de la spore(Michèle Mock - Maryse Moya-Nilges - Patricia Sylvestre)

La spore est à la fois la forme de persistance de B. anthracis dans l'environnement et la forme infectante qui enclenche l'infection après germination dans l'hôte. La structure la plus externe de la spore, l'exosporium, et son rôle dans l'interaction précoce avec l'hôte ainsi que sa contribution éventuelle dans l'immunoprotection sont analysés. Une glycoprotéine, appelée BclA (pour Bacillus collagen-like), s'est révélée être le composant structural des filaments situés à la surface de l'exosporium. La région centrale de BclA (CLR) présente une forte similitude avec le collagène mammifère. La région CLR est composée de répétitions de triplets GXX, majoritairement représentés par des triplets GPT. L'analyse de la séquence du gène bclA chez différentes souches de B. anthracis a révélé l'existence d'un polymorphisme de la taille de ce gène se traduisant pour les protéines BclA correspondantes par une variation de taille, laquelle est la conséquence du nombre variable de triplets GXX dans la région CLR. Toutes les souches analysées possèdent des filaments à la surface de l'exosporium. Cependant, selon les souches, ces filaments présentent des longueurs variables et nous avons montré par des expériences d'échanges de gènes que la variation de taille du CLR est directement responsable de la variation de longueur des filaments.

Toxines de Bacillus anthracis - Approches vaccinales et thérapeutiques(Ian Glomski - Pierre Goossens - Michèle Mock - Alex Piris Gimenez)

Bacillus anthracis produit deux toxines composées de trois protéines : la toxine létale (PA + LF) et la toxine œdématogène (PA + EF). PA (antigène protecteur) est le composant commun qui permet de fixer et de délivrer EF (facteur œdématogène) et LF (facteur léthal) dans les cellules eucaryotes cibles. EF est une adénylcyclase calmoduline-dépendante et LF, une métalloprotéase qui agit spécifiquement sur la famille des MAPKKinases. Des inhibiteurs spécifiques de l'activité enzymatique de LF et EF ont été trouvés et nous testons leur intérêt thérapeutique au cours de l'infection.

Des souches de B. anthracis produisant la protéine PA mutée dans ses différents domaines fonctionnels ont été construites. L'étude de leurs propriétés in vivo indique une corrélation entre les étapes du mode d'action cellulaire des toxines et le processus infectieux. Une souche isogénique de la souche vaccinale vétérinaire Sterne, produisant les protéines LF et EF génétiquement détoxifiées, confère une protection totale contre une épreuve létale chez l'animal de laboratoire.

Par ailleurs, nous développons un projet d'amélioration du vaccin à usage humain. En effet, celui mis au point dans les années 60, basé sur l'immunité envers les toxines via PA, est peu satisfaisant. Notre travail montre que l'adjonction de spores inactivées à PA augmente considérablement l'efficacité protectrice de ce vaccin, la rapprochant de celle du vaccin vivant. D'après les tests d'efficacité déjà réalisés sur modèles animaux, cette formule vaccinale offre des perspectives pour l'amélioration de la vaccination humaine. L'analyse des mécanismes de protection induits par ce protocole de vaccination est réalisée. Nous avons ainsi développé un modèle d'infection cutanée chez la souris de façon à caractériser, d'une part l'infection, localement, au niveau du site infecté, et d'autre part les mécanismes de dissémination à distance vers le/les ganglion(s) drainant(s) et dans l'organisme en son entier. La comparaison de ces événements chez l'hôte naïf et chez l'hôte immunisé nous permet de poser des hypothèses précises sur les mécanismes pouvant être mis en œuvre pour contrôler l'infection. En collaboration avec le CRESSA, un modèle d'infection par aérosol et par voie intranasale a été mis en place pour étudier l'efficacité de la vaccination sur une infection par voie respiratoire, ceci dans le cadre de la lutte contre le bioterrorisme.

A côté de l'étude de la réponse adaptative à la vaccination, nous étudions les mécanismes de l'immunité innée qui pourraient intervenir dans le contrôle précoce de la germination et de la dissémination de B. anthracis. Nous avons montré que la phospholipase A2 de type IIA, sécrétée par les macrophages alvéolaires humains ou de cobaye, exerce une activité bactéricide vis-à-vis de B. anthracis, que ce soit sur les spores germées ou les bacilles capsulés.

La germination de la spore peut avoir lieu dans le phagolysosome des macrophages. Cette étude est poursuivie par l'analyse de l'interaction entre les spores de différentes souches mutantes et recombinantes de B. anthracis avec des cellules hôtes potentielles (macrophages, cellules dendritiques), en particulier sur la relation entre la production des toxines au cours de l'infection et le profil de sécrétion des cytokines pro- ou anti-inflammatoires.

La surface du bacille (Sophie Bonnot - Thomas Candela - Sophie Davison - Agnès Fouet - Odile Mary-Possot)

Les bacilles isolés d'animaux malades du charbon sont capsulés. La capsule recouvre une couche structurée formant un réseau, appelée couche S. Cependant, capsule et couche S peuvent être synthétisées indépendamment. Deux protéines abondantes peuvent constituer la couche S. Elles sont synthétisées différemment au cours de la croissance et selon les milieux de culture. Ainsi, à tout moment une protéine domine et constitue la couche S. Une seule de ces protéines semble être synthétisée chez l'hôte. Les protéines de couche S possèdent, dans leur région N-terminale, un domaine qui permet l'ancrage à un polysaccharide associé au peptidoglycane. Ce mécanisme d'ancrage non covalent est retrouvé dans de nombreuses espèces bactériennes. Au sein du groupe B. cereus, seules des souches pathogènes possèdent une couche S.

La capsule a un rôle antiphagocytaire. Au moins trois protéines dont les gènes sont organisés en opéron, interviennent dans la synthèse de la capsule. Une quatrième protéine, dont le gène fait également partie de cet opéron, intervient dans la dégradation de l'excès de capsule. Cette protéine catalyse également l'ancrage covalent de la capsule au peptidoglycane. Un régulateur commun intervient pour contrôler la synthèse des composants des toxines, des composants de la souche S et des protéines de biosynthèse de la capsule.

Phylogénie et écologie de B. anthracis(Agnès Fouet - Michèle Mock - Patricia Sylvestre)

B. anthracis, B. cereus et B. thuringiensis appartiennent au groupe B. cereus. Une analyse biomoléculaire approfondie impliquant de nombreux B. cereus a permis de définir que, sur des bases génétiques, ces trois bactéries sont en fait une même espèce. PlcR, régulateur transcriptionnel de nombreux gènes exprimés en phase stationnaire (régulon PlcR) est présent et fonctionnel chez tous les B. cereus/B. thuringiensis, où il a été recherché. Curieusement, chez B. anthracis, le gène plcR est interrompu ; néanmoins le régulon est présent et l'addition, par recombinaison génétique, du gène plcR de B. thuringiensis en rétablit l'expression. Nous avons montré que la contre-sélection de PlcR chez B. anthracis provient de ce qu'en présence d'un régulateur central de B. anthracis, qu'il inhibe la sporulation, nécessaire à la persistance de cette bactérie dans l'environnement.

L'épidémiologie moléculaire du charbon en est à ses débuts. Cette zoonose des mammifères de répartition mondiale a considérablement régressé dans les pays occidentaux depuis la fin du siècle dernier. Néanmoins, le charbon existe toujours en France où il apparaît, chaque année, de façon sporadique dans diverses régions. Des études phylogénétiques sur une collection de souches françaises de B. anthracis, collectées par l'AFSSA, ont révélé qu'elles appartiennent aux deux grands groupes (incluant plus de 80 génotypes) définis mondialement. De plus, quatre génotypes sont définis uniquement par des souches françaises. L'approche moléculaire, utilisée dans ce travail, permet d'établir la provenance d'une souche analysée. Ces études sont désormais développées dans le cadre du CNR Charbon, créé en 2002.

Mots-clés: Anthrax, surface, toxins, virulence, spores, vaccine


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