Unité: Recherche sur les Streptocoques et Entérocoques

Responsable: Patrick TRIEU-CUOT

Notre recherche porte essentiellement sur la caractérisation des facteurs de virulence de Streptocccus agalactiae, un agent majeur des infections néonatales. A cette fin, les techniques de génétique et de biologie cellulaire sont combinées avec l'utilisation d'un modèle murin pour caractériser les gènes impliqués dans la virulence de ce pathogène. Parallèlement à cette recherche, nous étudions la dissémination de la résistance aux antibiotiques dans les entérocoques, les streptocoques et les bactéries apparentées. Le Laboratoire Mixte Pasteur-Necker de Recherche sur les Streptocoques a été fermé le 31 décembre 2003.

Les facteurs de virulence de Streptococcus agalactiae.

S. agalactiae, streptocoque du groupe B de Lancefield (SGB), est un constituant normal de la flore digestive humaine qui peut coloniser les voies urogénitales de la femme et respiratoires du nouveau-né. Cette bactérie est la principale cause d'infections (septicémie, méningite et pneumonie) chez le nouveau-né et est également responsable d'infections chez l'adulte, notamment sur terrain fragilisé. Les SGB peuvent être classés en sérotypes sur la base de l'immuno-réactivité de leur capsule polysaccharidique. Parmi les neuf sérotypes capsulaires caractérisés à ce jour, les types Ia, Ib, II, III et V sont responsables de la majorité des infections néonatales à SGB. Le sérotype capsulaire III est particulièrement important car il est fréquemment associé aux infections néonatales précoces qui surviennent au cours de la première semaine après la naissance et est responsable de la majorité des infections néonatales tardives qui surviennent après la première semaine. Ce sérotype est également responsable de la majorité des cas de méningites néonatales dues aux SGB.

La physiopathologie des infections à SGB implique que cette bactérie puisse i) échapper aux défenses immunitaires de l'hôte, ii) adhérer et envahir différents types de cellules épithéliales dont celles constituant l'épithélium pulmonaire et la barrière hémato-méningée et iii) s'adapter rapidement à des conditions de culture très différentes (pH, température, carences nutritives, ...).

1. Séquençage et annotation du génome de S. agalactiae NEM316 (En collaboration avec les Dr F. KUNST et Dr P. GLASER, Laboratoire de Séquençage des Micro-organismes Pathogènes, Institut Pasteur et avec le Dr T. MSADEK, Unité de Biochimie Microbienne, Institut Pasteur).

La souche de SGB séquencée est NEM316 (CIP 82.45, ATCC 12403). Cette souche a été responsable d'une septicémie fatale, appartient au sérotype III, est sensible aux antibiotiques, peut être modifiée génétiquement (électroporation, conjugaison) et est virulente dans un modèle murin. La séquence du chromosome de cette souche est maintenant achevée. Le génome de S. agalactiae NEM316 a une taille de 2.211.485 paires de bases et il contient 2.118 phases codantes. Cinquante-cinq pour cent de ces gènes putatifs possèdent un orthologue chez Streptococcus pyogenes et définissent ainsi le squelette génomique commun de ces 2 bactéries. Cinquante pour cent des gènes apparemment spécifiques de S. agalactiae sont regroupés dans 14 îlots qui contiennent par ailleurs des gènes de virulence connus ou putatifs, des gènes codant pour des protéines de surface et des gènes généralement associés à des éléments génétiques mobiles (transposases, intégrases). Certains de ces îlots pourraient donc correspondre à des îlots de pathogénicité. La structure du génome de S. agalactiae, unique chez les streptocoques dont le génome est connu (S. mutans, S. pyogenes et S. pneumoniae), pourrait résulter du rôle joué par ces îlots dans l'acquisition de la virulence et la diversité génétique.

2. Estérification des acides lipotéichoïques et virulence de S. agalactiae

La D-alanylation des acides lipotéchoïques (LTAs) permet aux bactéries à Gram positif de moduler leur charge de surface, de réguler la fixation de ligands et de contrôler les propriétés électromécaniques de leur paroi. Nous avons donc donc déterminé si la formation de D-alanyl LTAs était impliquée dans la virulence des SGB. Nous avons démontré qu'un mutant isogénique DltA- qui était incapable de synthétiser des D-alanyl LTAs présentait une susceptibilité accrue aux défensines humaines et animales. Cette souche mutante était également plus sensible que la souche sauvage à la lyse par des macrophages murins et par des neutrophiles humains. De plus, sa virulence était considérablement diminuée dans des modèles d'infection murin et de rat nouveau-né. Le mutant DltA- était éliminée plus rapidement que la souche sauvage des poumons de souris de 3 semaines infectées par voie intra-nasale et, par voie de conséquence, était incapable d'induire une pneumonie. Par ailleurs, après injection i.v., sa survie était significativement diminuée dans le sang et le cerveau de souris du même âge en comparaison de celle de la souche sauvage. Ces résultats suggèrent que la diminution de virulence du mutant DltA- était une conséquence de l'augmentation de sa susceptibilité aux peptides antibactériens cationiques et de sa lyse par les cellules phagocytaires. Ils démontrent que la D-alanylation des LTAs contribue à la virulence de S. agalactiae.

3. Protéines de surface et virulence de S. agalactiae

Les protéines de surface des bactéries pathogènes à Gram positif jouent un rôle essentiel dans la virulence en favorisant les interactions avec les cellules de l'hôte et l'échappement aux défenses immunitaires. Nous avons étudié les protéines qui sont covalemment attachées au peptidoglycane par l'intermédiaire d'un motif LPXTG carboxylique.

Les 2 réactions enzymatiques (endopeptidase-transpeptidase) nécessaire à cette liaison sont catalysées par une protéine membranaire appelée sortase (SrtA). Le rôle des protéines LPXTG dans la virulence de S. agalactiae a été étudié par deux approches complémentaires (construction d'un mutant sortase-déficient et inactivation des gènes codant pour des protéines LPXTG). L'analyse du génome de NEM316 a permis de caractériser un gène codant pour une protéine présentant respectivement 55% et 30% d'identité avec SrtA de Streptococcus gordonii et de Staphylococcus aureus. Un mutant SrtA- de S. agalactiae NEM316 s'est avéré incapable d'ancrer correctement à sa surface les protéines LPXTG Alp2 et ScpB, choisies comme prototypes. En comparaison de la souche sauvage, il adhérait significativement moins à la fibronectine et ainsi qu'aux lignées épithéliales humaines (A549, Hela, Caco-2) ou murines (L2). Sa virulence n'était pas sensiblement différente de celle de la souche sauvage dans le modèle du rat nouveau-né (LD50 et colonisation de poumon), mais il présentait une diminution de 4 log dans sa capacité à coloniser le tube digestif de souris axénique en situation de compétition. Ces résultats suggèrent que SrtA est nécessaire au portage digestif et vaginal des SGB chez l'homme.

Une analyse in silico du génome de NEM316 a révélé la présence de 30 protéines de surface putatives possédant le motif d'ancrage de type LPXTG. Nous avons étudié par PCR la distribution des gènes codant pour 21 protéines LPXTG dans une collection de 99 souches non-redondantes de SGB responsables d'infections non invasives (70 souches provenant de portages vaginales ou d'infections urinaires) et invasives (29 souches provenant d'hémocultures ou de méningites). Cette étude a montré que 6 de ces gènes étaient présents dans toutes les souches de notre échantillonnage. La fonction des protéines correspondantes et la possibilité de les utiliser comme cible vaccinale est en cours d'investigation.

Mots-clés: Streptococcus agalactiae, génomique, expression génique, virulence, taxonomie moléculaire


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